Morpholino oligos er avancerede værktøjer til blokering af steder på RNA for at hindre cellulære processer. En Morpholino-oligo binder specifikt til det valgte målsted for at blokere adgangen for cellekomponenter til det pågældende målsted. Denne egenskab kan udnyttes til at blokere translation, blokere splejsning, blokere miRNA’er eller deres mål og blokere ribozymaktivitet.
Translationsblokering: Ved sterisk at blokere translationsinitieringskomplekset kan Morpholinos slå ekspressionen af mange målsekvenser fuldstændig ned, så meget at efter at have ventet på, at det eksisterende protein nedbrydes, forsvinder målproteinbåndet fra Western blots. I modsætning til mange antisense-typer (f.eks. siRNA, phosphorothioater) forårsager Morpholinos generelt ikke nedbrydning af deres RNA-mål; i stedet blokerer de den biologiske aktivitet af mål-RNA’et, indtil dette RNA nedbrydes naturligt, hvorved Morpholinos frigives. Dette betyder, at RT-PCR ikke er egnet til at undersøge translationsblokering ved hjælp af morpholinos.
Spliceblokering: Ved at blokere steder, der er involveret i splejsning af pre-mRNA, kan Morpholinos anvendes til at ændre og kontrollere normale splejsningsprocesser. Denne aktivitet kan nemt testes ved hjælp af RT-PCR, idet en vellykket splejsningsmodificering viser sig som ændringer i RT-PCR-produktbåndet på en elektroforesetisk gel. Båndet kan skifte til en ny masse, eller hvis splejsningsmodificering udløser nonsense-medieret henfald af transkriptet, vil det vilde splejsede bånd miste intensitet eller forsvinde.
Som alle gen-nedbrydningsreagenser skal Morpholinos aktivt leveres ind i de fleste celler. Morpholinos kan leveres til dyrkede celler ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder skrabning af adhærente celler, elektroporation og endda mikroinjektion. Vores Endo-Porter-leveringsreagens giver imidlertid generelt en fremragende levering i dyrkede celler med hensyn til mængden af Morpholino leveret pr. celle, jævn fordeling i en population af celler, reproducerbarhed af levering og ikke-toksicitet for de fleste celletyper ved den anbefalede koncentration. Til dyreforsøg trænger vores Vivo-Morpholinos med deres tilknyttede leveringsenhed ind i cellerne fra blodet efter i.v. administration eller ind i cellerne i væv omkring lokale injektioner; de er også de mest bekvemme antisense oligoer til brug i cellekulturer eller explantationer, da de ikke kræver noget yderligere middel til cytosolisk levering.
En morpholino-oligo er radikalt forskellig fra naturlige nukleinsyrer, idet methylenemorpholinringe erstatter ribose- eller deoxyribose-sukkerdelene og ikke-ioniske phosphorodiamidatbindinger erstatter de anioniske phosphater i DNA og RNA. Hver morpholinring placerer en af DNA’s standardbaser (A,C,G,T) på en passende måde med henblik på parring, således at en 25-base Morpholino-oligo binder stærkt og specifikt til sit komplementære 25-base-målsted i en RNA-streng via Watson-Crick-parring. Da Morpholino-oligoens uladede rygsøjle ikke genkendes af enzymer, er den fuldstændig stabil over for nukleaser.
Vi opfordrer dig til at bringe et mere præcist og kraftfuldt værktøj i spil til at løse dine eksperimentelle udfordringer. Ring til vores kundesupportgruppe på ph.d.-niveau hos Gene Tools for at komme i gang med Morpholinos i dine undersøgelser. Telefon: (541) 929-7840 ext. 1.
- Vurdering af levering
- Løselighed og Morpholinos
Som med alle gen-nedbrydningsmidler er effektiv levering af Morpholinos afgørende. Mens det ikke er afgørende at bekræfte leveringen ved forsøg med embryonal mikroinjektion, er det vigtigt at bekræfte leveringen ved forsøg med dyrkede celler. Vores Endo-Porter-leveringsreagens giver generelt en enkel og pålidelig levering for de fleste celletyper. Du kan vurdere, om du får en god levering til cytosolen i dine celler ved at bruge en fluorescerende mærket Morpholino. Vi anbefaler, at du bruger vores billige fluorescein-tagged Standard Control oligo til dette formål.
Når du bruger en fluorescerende Morpholino til at bekræfte levering, skal du starte med en koncentration på 10 microMolar Morpholino oligo i kulturmediet. Dette er en tilstrækkelig høj koncentration til, at den fluorescerende morfolino efter 16 timer bør være synlig i cytosolen ved fluorescensmikroskopi. Et inverteret fluorescensmikroskop er det bedste valg til observation af celler i kulturplader. Der skal observeres levende (ufikserede) celler. Brug en tør objektivlinse med den højeste tilgængelige numeriske åbning for at samle så meget lys som muligt fra cellerne. En vellykket afgivelse viser sig ved diffus fluorescens i hele cytosolen. Punktvis fluorescens indikerer normalt, at oligoen er fanget i endosomer, så ignorer punktvise pletter og kig efter den diffuse fluorescens.
For egentlige eksperimenter, der leverer din brugerdefinerede Morpholino-sekvens med Endo-Porter, har du generelt brug for en koncentration på kun 1 til 5 microMolar for effektiv sterisk blokering af de fleste mRNA’er.
Og selv om Morpholino-oligoer er meget mere opløselige end andre ikke-ioniske strukturtyper (såsom PNA’er), har nogle Morpholinos med højt G-indhold (>30 %) begrænset opløselighed. Desuden nedsætter tilknytning af vores rødemitterende lissaminfluor undertiden oligoens opløselighed. Opløseligheden varierer med oligosekvensen og er vanskelig at forudsige. Anbefalingerne nedenfor kan hjælpe med at opretholde oligoaktiviteten, hvis din sekvens har dårlig opløselighed.
For langtidsopbevaring opbevares dine Morpholino-stamopløsninger bedst lyofiliseret, Det næstbedste valg er opbevaring i opløsning ved stuetemperatur. Fremstilling af Morpholino-stamopløsninger ved eller under 1 milliMolar hjælper til at undgå opløselighedsproblemer. Vi anbefaler opbevaring ved stuetemperatur i tæt forseglede beholdere, og for at undgå fordampning i tilfælde af en defekt forsegling af hætteglasset er det klogt at opbevare lagrene i et fugtigt miljø, f.eks. i en humidor (f.eks. en klokke med et åbent bægerglas med vand) for at undgå fordampning i tilfælde af en defekt forsegling af hætteglasset. Pas på, at oligoerne ikke tørrer ud, da det kan være vanskeligt eller umuligt at opløse en indtørret oligo igen (frysetørrede oligoer opløses dog ret let). Det er en god idé at opbevare hætteglasset i en mørk kasse eller indpakket i folie, da fluor-mærkede oligoer kan fotoblegme i lys.
Aggregation i opløsning kan medføre et fald i den biologiske aktivitet over tid, og dette kan forekomme i opløsninger, der opbevares ved stuetemperatur. Dette kan i nogle tilfælde vendes ved opvarmning i 5 min. ved 65C eller i de fleste tilfælde ved autoklavering (brug væskecyklussen). Oligoerne er meget varmestabile og kan tåle flere omgange autoklavering uden nedbrydning. Ofte vil autoklavering genoplive en stamme, der har mistet en vis aktivitet på grund af aggregering af oligoerne.
DNA, RNA og de fleste gen-nedbrydningsreagenser opbevares typisk i et isbad under eksperimenterne for at minimere nedbrydning ved nukleaser. Da Morpholinos er fuldstændig resistente over for enzymatisk nedbrydning, og vandige opløsninger er kemisk stabile på ubestemt tid (år) ved stuetemperatur, anbefaler vi, at du under dine eksperimenter opbevarer dine stamopløsninger af Morpholinos ved stuetemperatur. Ved at afkøle dine stamopløsninger i et isbad risikerer du blot at få Morpholinoerne til at udfælde.
Disse forholdsregler er mere end nødvendige for de fleste sekvenser, men deres rutinemæssige anvendelse er med til at undgå ubehagelige overraskelser i tilfælde af, at du støder på en sekvens med lav opløselighed.