Indledning

4-hydroxy-l-prolin (hydroxyprolin) er en ikke-proteinogen aminosyre, der har en molekylvægt på 131,13 g/mol og syntetiseres ved posttranslationel hydroxylering af prolin under kollagenbiosyntesen (Fig. 1). Ved undersøgelser af fysiologisk og patologisk kollagenmetabolisme anvendes oftest målinger af hydroxyprolin i plasma, urin og kropsvæv. Bestemmelse af hydroxyprolin giver derfor nyttige oplysninger til diagnosticering og prognose af sygdomme, der skyldes forstyrrelser i kollagenmetabolismen (1). Sådanne tilstande omfatterhyperthyreoidisme, hyperparathyreoidisme, akromegali, Pagets sygdom, osteomalaci, rakitis, Marfans syndrom, osteogenesis imperfecta, sklerodaktyli, dermatomyositis og Cushings syndrom (2).

Fibrose, der opstår i lever, lunger, nyrer, hud og andre organer, kan udvikle sig til kroniskichepatitis, leversklerose, leverkræft, lungefibrose og glomerulonefritis (3). Det er derfor meget vigtigt at forebygge udviklingen og reducere sværhedsgraden af fibrose hos patienter, der er indlagt. Hydroxyprolin fungerer som en vigtig diagnostisk indikator for fibrosens sværhedsgrad.

Måling af hydroxyprolin i plasma, urin og kropsvæv er mulig ved kolorimetriske metoder, højtydende væskekromatografi (HPLC) og flowinjektionsanalyser (4-6). Disse metoder kræver imidlertid store mængder prøver på grund af deres lave følsomhed. Desuden kræver HPLC en lang separationstid for hver prøve. I de seneste år har væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) vist sig at være fordelagtig på grund af dens høje følsomhed og korte separationstid.LC-MS er blevet anvendt til måling af lave koncentrationer af stoffer i urin og urin med forurenede stoffer (7-9). Formålet med den foreliggende undersøgelse var at anvende den nye LC-MS-metode til måling af hydroxyprolin. Som en indikator for fibrose blev hydroxyprolin i lever og lunge i en rottemodel af fibrose målt ved hjælp af LC-MS og sammenlignet med tidligere resultater opnået ved hjælp af HPLC- og kolorimetriske metoder.

Materialer og metoder

Etisk erklæring

Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af den etiske komité ved Harbin Medical University (Harbin, Kina). En standardprocedure for indhentning af skriftligt informeret samtykke var inkluderet i protokollen og blev godkendt af den etiske komité ved Harbin Medical University.

Reagenser

Dimethylnitrosamin (DMN) og hydroxyprolin blev indhentet fra Nacalai Tesque Inc. (Kyoto, Japan). Nembutal blev købt hos Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Osaka, Japan) ogbleomycin blev indhentet fra Nihon Kayaku Inc. (Tokyo, Japan). Alle andre kemikalier var af reagenskvalitet.

Fremstilling af en model af lunge- og leverfibrose hos rotter

En model af lungefibrose blev skabt hos fem uger gamle Wistar-rotter ved injektion af bleomycin (BLM, 0,30U/100 g, i.p.) i luftrøret under nembutal (50 mg/kg) bedøvelse.Raske rotter blev injiceret med 0,9% saltvand (kontrol).

En model af leverfibrose blev skabt hos syv uger gamle Wistar-rotter ved en enkelt injektion af DMN (40 mg/kg, i.p.). Normale raske rotter var kontrollerne og blev injiceret med0,9% saltvand (kontrol). Præparationen af lungefibrosemodellen og af opsamlingsvævet var baseret på de metoder, der er beskrevet i de tidligere undersøgelser (10,11).

Måling af hydroxyprolin i en rottemodel af lungefibrose ved en kolorimetrisk metode

Den venstre lunge blev fjernet, vejet (~0.3 g) og homogeniseret i 5% trichloreddikesyreopløsning (x10 volumen) ved hjælp af en cellehomogenisator (Eilard, Berlin, Tyskland) ved 8.000 × g (4°C) i2 min i et isbad. Cellerne blev centrifugeret (2 500 × g, 4°C) i 20 min, og supernatanten blev vasket to gange med destilleret vand. Derefter blev 6 N HCl tilsat ved 110 °C helt i begyndelsen og reagerede i 16 timer. Efter endt reaktion blev toluen (3 ml) tilsat, og blandingen blev omrystet i 20 minutter. Efter centrifugering (3 000 × g, 20 °C) i 10 min blev det organiske lag opsamlet, og p-dimethylaminobenzaldehyd blev tilsat.Hydroxyprolin i prøven blev påvist ved hjælp af et multipladespektrometer (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ved 560 nm.

Måling af hydroxyprolin i lever ved HPLC

Den venstre lunge blev fjernet, vejet (~0,3 g) og homogeniseret i 5 ml ethanol ved hjælp af en cellehomogenisator (Eilard) ved8 000 × g (4°C) i 2 min. i et isbad. Homogenatet blev centrifugeret (2 500 × g, 4°C) i 20 min, og supernatantet blev opsamlet. Væsken (1 ml) blev opsamlet og opvarmet i 8 timer ved 60 °C, indtil den var tør. Efter opløsning af restproduktet i 40 μl ethanol og 80 μl boratbuffer (0,1 M, pH 8) blev 40 μl4-fluor-7-nitrobenzofurazan (100 mM) tilsat som fluorescensreagens. Reaktionen fik lov til at fortsætte ved stuetemperatur i 15 timer i mørke. Derefter blev der tilsat 840 μl saltsyre (6 mol/l) for at afslutte reaktionen. Efter centrifugering (2 500 × g, 20 °C) i 20 minutter blev supernatanten fjernet til HPLC-analyse.

Der blev anvendt et Hitachi L6000 HPLC-system (Hitachi HighTechnologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA).Detektion blev udført med et Hitachi L7480 fluorescensspektrometer (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japan; excitation ved 475 nm, emission ved 530 nm). Kolonnen (HitachiHigh-Technologies Corporation) var en YMC Pack ODS-AQ (150×6,0 mmID) ved stuetemperatur. Den mobile fase var acetonitril: vand(35:65-50:50 gradient over 15 min) og flowhastigheden var 1ml/min.

Måling af hydroxyprolin ipulmonal og leverorganisation ved LC-MS

Den venstre lunge blev fjernet, vejet (~0.3 g) og homogeniseret i 5% trichloreddikesyreopløsning (x10 volumen) ved hjælp af en cellehomogenisator (Eilard) ved 8.000 × g (4°C) i 2 min i et isbad. Cellerne blev centrifugeret (2 500 × g, 4°C) i 20 min. Den overskydende væske blev vasket to gange med destilleret vand. Derefter blev der tilsat 6 N HCl ved 110 °C i 16 timer, og prøverne blev forberedt til måling. Leveren blev fjernet, vejet (~0,3 g) og homogeniseret i 5 ml ethanol ved hjælp af en cellehomogenisator (Eilard) ved8 000 × g (4 °C) i 2 minutter i et isbad. Homogenatet blev centrifugeret (2500 × g, 4°C) i 20 min, supernatanten blev opsamlet, og prøverne blev forberedt til måling.

Koncentrationen af hydroxyprolin blev bestemt efter en LC-MS-metode ved hjælp af et LC-MS2020-system (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). Med hensyn til LC var den mobile fase 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4. Søjlen var Shin-pack VP-ODS (150×2 mm i diameter). Strømningshastigheden var 0,2 ml/min. Med hensyn til MS blev der anvendt kemisk ionisering i atmosfærisk atmosfære (APCI). Der blev også anvendt positiv iondetektion. Sondeelektronspændingen var 4,5 kV, og sondestrømmen var 4,2 μA. APCI-sondetemperaturen var 250 °C, og elektronspændingen ved den buede desolvationslinje (CDL) var -30,0 V. CDL-temperaturen var 250 °C og bloktemperaturen 20 °C. Forspændingen for Q-arrays 1, 2 og 3 var henholdsvis 5,0, 25,0 og 35,0 V. Q-array RF-elektronspændingen var 150,0 V.

Statistisk analyse

Forskellene mellem grupperne blev undersøgt ved hjælp af envejs variansanalyse. Hvis der ikke blev konstateret en signifikant forskel, blev forskellen mellem grupperne undersøgt ved hjælp af Bonferroni-metoden. Korrelationer blev undersøgt ved hjælp af en tosidet-test. P<0,05 blev anset for at angive en statistisk signifikant forskel.

Resultater

Måling af hydroxyprolinkoncentrationen ved LC-MS

MS-kromatogram af hydroxyprolin

Massespektret af hydroxyprolin er vist i fig. 2. MS af hydroxyprolinestandard (80 pg/ml) resulterede i fragmenttoppe med en molekylmasse på 173,0 (molekylær ion + eddikesyre-vand) genereret fratilsætning til eddikesyre-ammonium for at øge antallet af ionmolekyler (molekylær mængde, 131,15) og ionstyrke.

LC-MS-kromatogram afhydroxyprolin

LC-betingelserne var som følger: Mobile fase, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; kolonne,Shin-pack VP-ODS (150×2 mm diameter); flowhastighed, 0,2 ml/min og ultraviolet (UV) detektion ved 230 nm. MS blev udført ved hjælp afAPCI-ioniseringsmetoden, og iondetektionen var positiv.

Kromatogrammet for LC-MS-selected ion monitoring (SIM) af hydroxyprolin (m/z, 173,0) er vist i fig. 3. Som det blev observeret for hydroxyprolinstandarden, blev der observeret en top ved 1 ng/ml ved en retentionstid på 2,213 min. Der blev også observeret en skarp top ved 50 ng/ml. Ved 1 μg/ml, som var 1 000 × standardkoncentrationen, blev der noteret en lille top i LC-UV-spektret (230 nm).

Følsomhed af LC-MS-detektion for hydroxyprolin

LC-MS-SIM-standardkurven for hydroxyprolin (m/z, 173,0; molekylær ion + eddikesyre-vand) er vist i fig. 4. Ved anvendelse af peak area-metoden til standardkurven udviste hydroxyprolin et skarpt peak ved 35 ng/ml (fig. 3). Ved koncentrationer <35 ng/ml blev der imidlertid ikke observeret en korrelation mellem topområderne. Fra 35-560 ng/ml blev der observeret en korrelation mellem topområderne, og standardkurven var en ret linje. Ved 60 og 80 μg/ml var topområderne næsten identiske. Ved koncentrationer >60 μg/ml blev der ikke observeret en korrelation mellem topområderne.

LC-MS-kromatogram og MS-spektrum afhydroxyprolin i en model af lunge- og leverfibrose hos rotter

Figur 5 viserLC-MS-kromatogram og MS-spektrum med SIM-detektion afhydroxyprolin (m/z 173,0; molekylær ion + eddikesyre-vand) i en lungemodel af fibrose hos rotter. I LC-MSch-kromatogrammet af lungen blev der i lighed med hydroxyprolinstandarden observeret en tydelig top ved m/z 173,0 ved en opholdstid på 2,213 min. Hydroxyprolin blev identificeret ved atm/z 131,15 i massespektret.

Figur 6 illustrerer LC-MS-kromatogrammet og MS-spektret med SIM-detektion af hydroxyprolin (m/z 173,0; molekylær ion + eddikesyre-vand) i fibrotisk levervæv fra rotter. Som det blev observeret for hydroxyprolin-standarden, blev der konstateret en top ved en retentionstid på 2,213 min i LC-MS-kromatogrammet og MS-spektret.

Hydroxyprolinkoncentration i lungevæv (kolorimetrisk metode og LC-MS-metode)

Den kolorimetriske metode og LC-MS-metoden til bestemmelse af hydroxyprolinkoncentrationen i lungevæv fra rotter er sammenlignet i fig. 7. Hver kolonne repræsenterer middelværdien ± standardafvigelsen af ni forsøg. Ifølge den kolorimetriske metode var hydroxyprolinkoncentrationen i rottelungevæv i den BLM-infunderede gruppe (652,3 ± 70,0 μg/venstre lunge) signifikant højere end i kontrolgruppen (547,1 ± 52,3 μg/venstre lunge; P<0,05). I henhold til LC-MS-metoden havde den BLM-infunderede gruppe(610,9±50,3 μg/venstre lunge) en signifikant højere værdi sammenlignet med kontrolgruppen (493,3±53,5 μg/venstre lunge; P<0,05).Hydroxyprolinkoncentrationen i rottelungevæv målt ved LC-MS-metoden havde imidlertid en lavere værdi sammenlignet med den, der blev målt ved den kolorimetriske metode.

Hydroxyprolinkoncentrationerne i rottelungevæv målt ved kolorimetriske og LC-MS-metoder er sammenlignet i fig. 8. Der blev konstateret en korrelation mellem den kolorimetriske metode og LC-MS-metoden til bestemmelse af hydroxyprolinkoncentrationen i lungevæv i kontrolgruppens lungevæv (r=0,972). Tilsvarende blev der konstateret en korrelation mellem den kolorimetriske metode og LC-MS-metoden til bestemmelse af hydroxyprolinkoncentrationen i lungevævet i den BLM-infunderede gruppe (r=0,918).

Hydroxyprolinkoncentrationen i rottelevervæv ved fluorescensmærkning og LC-MS-metoder

Vurderingen af hydroxyprolinkoncentrationen i rottelevervæv ved fluorescensmærkning og LC-MS-metoder er illustreret i fig. 9. Ifølge fluorescensmærkningsmetoden var hydroxyprolinkoncentrationen i rottelevervæv i den DMN-infunderede gruppe (105,4 ± 36,5 μg/g) signifikant højere sammenlignet med den i kontrolgruppen (30,3 ± 2,7 μg/g; P<0,05). Også i henhold tilLC-MS-analyse udviste den DMN-infunderede gruppe (190,4±70,3 μg/g)en signifikant højere værdi sammenlignet med kontrolgruppen (62,4±6,8 μg/g; P<0,05). Hydroxyprolinkoncentrationen i rottelevervæv målt ved LC-MS var imidlertid højere sammenlignet med den, der blev målt ved fluorescensmærkningsmetoden.

Hydroxyprolinkoncentrationen i rottelevervæv vurderet ved fluorescensmærkning og LC-MS-metoder er korreleret i fig. 10. Hydroxyprolinkoncentrationen i levervævet i kontrolgruppens levervæv, der blev vurderet ved hjælp af fluorescensmærkning, korrelerede med den koncentration, der blev opnået ved hjælp af LC-MSmetoden (r=0,957). Ligeledes korrelerede hydroxyprolinkoncentrationen i levervævet i den DMN-infunderede gruppe opnået ved hjælp af fluorescensmærkningsmetoden med den, der blev opnået ved hjælp af LC-MS-metoden (r=0,981).

Diskussion

Hydroxyprolin er en type aminosyre, der findes i albumen. Prolinresten i proteinet hydroxyleres af4-monooxgenase for at generere 4-hydroxy-2-oxoglutinsyre, som omdannes til alanin og glycin via 4-glutaminsyre i det menneskelige legeme. I hvert af kroppens indre organer kan inflammation og fibrose give anledning til ophobning af komponenter i den ekstracellulære matrix (ECM) (12), men under patologiske forhold kan der opstå yderligere fibrose i lever, lunger og nyrer (13,14).Kronisk hepatitis og leversklerose er forbundet med fibrose og har også en tæt sammenhæng med leverkræft (15).

I lungerne er fibrosens sværhedsgrad afhængig af typen af lungebetændelse (16).Normalt ledsages lungefibrose af interstitiel lungebetændelse (17). Fibrose i indre organer er forårsaget af proliferation af ECM-komponenter, der aflejres af myofibroblaster. For at forstå udviklingen af fibrose skal der foretages en undersøgelse af kollagenkoncentrationen. Hydroxyprolinkoncentrationen er forbundet med kollagen som en indikator for fibrosens alvorlighedsgrad (18-20). Hydroxyprolin er vigtigt som et indeks for sygdom forårsaget af kollagenproliferation (som infibrose) og stofskiftefejl.

I de seneste år har LC-MS vist sig at være en meget følsom detektionsmetode (7,8,21).LC-MS består af en LC- og MS-komponent og den grænseflade, der forbinder dem. LC-delen er identisk med konventionel HPLC. Prøven ioniseres af grænsefladedelen. Termospray-ionisering giver ustabile (flygtige) produkter, så der blev anvendt APCI (som ioniserer materialet, men ikke opløsningsmidlet, efter forstøvning med opløsningsmiddel under atmosfærisk tryk). Elektrosprayionisering (ESI)kan anvendes til ionisering af molekyler med høj polaritet og høj molekylvægt, hvilket er ideelt egnet til grænsefladekomponenten. i den foreliggende undersøgelse var ESI imidlertid ikke tilpasset til temamåling af hydroxyprolin i kropsprøver, da ESI ikke blev ledsaget af termospray i tilfælde af ionisering. Det var en mere enkel procedure at måle hydroxyprolin kombineret med Na+ ved at tilsætte yderligere Na+ til prøven.

MS-spektret af hydroxyprolin viste toppe med m/z 173,0 og 131,15. m/z 173,0 blev identificeret som den top, der repræsenterer eddikesyresalt, der stammer fra det eddikesyreammonium, der blev tilsat til den mobile fase for at øge den ioniske styrke. Da den sammenlignende styrke af m/z 131.15 og 173.0 er omtrent identisk i MS-spektret, blev ionen m/z 173.0 desuden valgt af SIM i MS-kromatogrammet for at undgå interferencetoppen fra den mobile fase.

I MS-kromatogrammet af hydroxyprolinstandarden ved 1 ng/ml blev der observeret en top i SIM-målingen med m/z 173.0. I UV-spektret (230 nm) af hydroxyprolin ved 1 μg/ml, som var 1 000 × standardkoncentrationen, blev der observeret en lille top (målingen blev udført samtidig med LC-målingen).

På koncentrationer <35 ng/ml blev der blandt topområderne ikke observeret nogen stærk korrelation mellem de forskellige metoder, og det var ikke muligt at opstille en standardkurve. Det blev formodet, at analysanden kan være blevet påvirket af den mobile fases peak, da hydroxyprolin har en forholdsvis lav molekylvægt (131,15). Desuden kan topens retentionstid være blevet ustabil på grund af opløsningsmidlets polaritet ved lave koncentrationer (hydroxyprolinkoncentration <35 ng/ml).

Der blev opstillet en hypotese om, at det kan være muligt at måle koncentrationer af stoffer så lave som pg/ml-niveauet. For toppen af hydroxyprolin i MS-kromatogrammet var retentionstiden kort (2,213 min). Hydroxyprolins evne til at blive fastholdt på ODS-kolonnen var svagere end oprindeligt foreslået.Den relative ionstyrke i MS-spektret ved m/z 131,15 og 173,0 var omtrent identisk, og derfor valgte interferencetoppen i den mobile fase en ion på m/z 173,0. I LC-MS-kromatogrammet af hydroxyprolin i lunge- og levervæv blev der observeret en skarp top ved m/z 173,0 ved en opholdstid på 2,213 min, ligesom for hydroxyprolinstandarden. Med hensyn til MS-spektret blev hydroxyprolins molekylære ion-top (m/z 131,15) bekræftet.

Måling af hydroxyprolinkoncentrationen i lunge- og levervæv ved hjælp af LC-MS blev sammenlignet med den koncentration, der blev opnået ved den kolorimetriske metode samt en fluorescensmetode ved hjælp af HPLC fra en tidligere undersøgelse foretaget af vores gruppe. Der blev konstateret en meget signifikant positiv korrelation. Værdien af hydroxyprolinkoncentrationen i lungen, der blev opnået ved den kolorimetriske metode, var dog højere end den værdi, der blev opnået ved LC-MS. Endvidere var hydroxyprolinkoncentrationen i leveren opnået ved fluorescensmetoden ved hjælp af HPLC lavere sammenlignet med den værdi, der blev opnået ved LC-MS (som skulle være en høj absorbans af alle komponenter i prøven ved en konstant bølgelængde på 560 nm).

Sammenfattende blev hydroxyprolin, som en indikator for fibrose, målt ved kolorimetriske og HPLC-metoder i tidligere undersøgelser foretaget af vores gruppe. Til sammenligning viste nærværende undersøgelse, at LC-MS-metoden var mere fordelagtig, da den var kendetegnet ved sin enkle proces, høje følsomhed (pg-niveau) og korte separationstid. Yderligere undersøgelser med større prøvestørrelser er berettigede til at bekræfte disse resultater.

Anerkendelser

Forfatterne er taknemmelige over for M. Kusunose, M. Ono ogA. Hamada (Department of Pharmacy, Kochi Medical School, Kochi, Japan) for at have stillet adskillige reagenser, der er anvendt i denne undersøgelse, nyttige forslag og teknisk ekspertise til rådighed. Dette arbejde blev finansieret af det offentlige sundhedsministerium i Heilongjiang-provinsen (nr. 2013365) iChina.

	Kitchener RL og Grunden AM: Prolidasefunktion i prolinmetabolismen og dens medicinske og bioteknologiske anvendelser. J Appl Microbiol. 113:233-247. 2012. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Myllyharju J: Prolyl 4-hydroxylaser, keyenzymes in the synthesis of collagens and regulation of theresponse to hypoxia, and their roles as treatment targets. Ann Med.40:402-417. 2008. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wick G, Grundtman C, Mayerl C, et al: Theimmunology of fibrosis. Annu Rev Immunol. 31:107-135. 2013.Se artikel : Google Scholar
		Hofman K, Hall B, Cleaver H og MarshallS: High-throughput quantification of hydroxyproline foretermination of collagen. Anal Biochem. 417:289-291. 2011.Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	McAnulty RJ: Metoder til måling af hydroxyprolin og estimering af in vivo hastigheder for kollagensyntese og -nedbrydning. Methods Mol Med. 117:189-207. 2005.PubMed/NCBI
	McCooeye M og Mester Z: Sammenligning af elektrospraymassespektrometri og tandemmassespektrometri med lav injektionsanalyse og elektrospraymassespektrometri med højfelt asymmetrisk bølgeformionmobilitetsmassespektrometri og tandemmassespektrometri til bestemmelse af underivatiserede aminosyrer. Rapid Commun MassSpectrom. 20:1801-1808. 2006. Se artikel : Google Scholar
	Jemal M og Xia YQ: LC-MS Developmentstrategies for quantitative bioanalysis. Curr Drug Metab.7:491-502. 2006. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chen G og Pramanik BN: LC-MS for proteincharacterization: current capabilities and future trends. ExpertRev Proteomics. 5:435-444. 2008. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Becker S, Kortz L, Helmschrodt C, et al:LC-MS-baseret metabolomik i det kliniske laboratorium. J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci. 883-884:68-75. 2012.
	Cui T, Kusunose M, Hamada A, et al:Relationship between the eosinophilia of bronchoalveolar lavagefluid (BALF) and the severity of pulmonary fibrosis induced bybleomycin in rats. Biol Pharm Bull. 26:959-963. 2003. Se artikel : Google Scholar
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, Hamada A, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosisin dimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Maruyama K: Hydroxproline. Nihon Rinsho.62(Suppl 12): 220-223. 2004.(På japansk).
	Muiznieks LD og Keeley FW: Molecularassembly and mechanical properties of the extracellular matrix: Afibrous protein perspektiv. Biochim Biophys Acta. 1832:866-875.2013. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lu P, Takai K, Weaver VM og Werb Z:Extracellular matrix degradation and remodeling in development anddisease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3:a0050582011.PubMed/NCBI
	Pungpapong S, Kim WR og Poterucha JJ:Natural history of hepatitis B virus infection: an update forclinicians. Mayo Clin Proc. 82:967-975. 2007. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Strieter RM og Mehrad B: New mechanismsof pulmonary fibrosis. Chest. 136:1364-1370. 2009. Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Swigris JJ og Brown KK: Acuteinterstitial pneumonia and acute exacerbations of idiopathicpulmonary fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 27:659-267. 2006.Se artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effekter af Sho-saiko-to ekstrakt på leverfibrose i relation til ændringerne i hydroxyprolin- og retinoidniveauet i leveren hos rotter. J Pharm Pharmacol. 51:1079-1084. 1999. View Article : Google Scholar
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on HGF and TGF-beta levels ofintraorgans in liver-injured roats after partial hepatectomy. JPharm Pharmacol. 52:111-118. 2000. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, et al: Effect ofSho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosis indimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holčapek M, Jirásko R og Lísa M: Recentdevelopments in liquid chromatography-mass spectrometry and relatedtechniques. J Chromatogr A. 1259:3-15. 2012.