Vi anvendte glukose, glukose og glutamin næringsstofkilder til at tyde kulstofstrømmen i K562-celler og ændringer i respons på BaP-behandling. Samlet set observerer vi den største mængde af mærkningsinkorporering i riboseenheder og laktat (se og Yderligere fil 1: Figur S1 for detaljer om mærkningsfordelinger). Som illustreret i Fig. 1 kan det forventes, at mærkningsinkorporering i Krebs-cyklusen fra glukose kan give to klart forskellige mærkningsmønstre af Krebs-cyklusmetabolitter afhængigt af, om C2-fragmentet kommer ind via pyruvatcarboxylase (PC) eller pyruvatdehydrogenase (PDH). Det pyruvat, der dannes fra glukose, vil give glutamat via PDH, men glutamat via PC-aktivitet. Da PC-aktivitet producerer oxaloacetat fra pyruvat, forventer man malat afledt af PC, mens PDH-produktet vil være malat eller malat.

NMR-spektre viser, at store mængder aspartat og malat er PC-afledte

Som vist i Fig. 2, observeres der signifikante forskelle mellem celler, der behandler glukose i 3 vs. 24 timer for resonanserne af malat og aspartat. Disse forskelle manifesterer sig fortrinsvis i en ændring af NMR-koblingskonstanterne. Størrelsen af disse koblingskonstanter afhænger af arten af det tilstødende kulstofatom: en carboxylsyregruppe giver en meget større koblingskonstant end en CH2-gruppe. Koblingskonstanten for 13C1 13C2-delen i aspartat eller malat er ca. 50-60 Hz, mens koblingskonstanten for en 13C2 13C3-delen er ca. 35-40 Hz.

For en 24 timers mærkningsperiode viser Fig. 2 tilsyneladende koblingskonstanter på 53 Hz for C2 af malat og aspartat. Denne store tilsyneladende koblingskonstant viser, at koblingen af C2 med den tilstødende C1-carboxylsyregruppe er fremherskende. Dette 13C1 13C2-koblingsmønster (og også 13C3 13C4, se Additional file 1) skyldes PDH-aktiviteten og muligvis også metabolitter, der passerer flere gange gennem Krebscyklus i en længere mærkningsperiode.

For den korte 3-h-mærkningsperiode observeres de mindre tilsyneladende koblingskonstanter på 47 og 41 Hz for C2 (fig. 2 og Additional file 1: figur S1), hvilket indikerer, at koblingen til den tilstødende methylen C3 dominerer. Tilstedeværelsen af 13C2 13C3-delen ved kortere mærkningsperioder viser, at det produkt, der stammer fra PC-aktiviteten, dominerer for kortere mærkningsperioder.

Det skal bemærkes, at de observerede signalopdelinger ikke repræsenterer de præcise skalare koblingskonstanter i en blanding af mærkede forbindelser. Ikke desto mindre giver den observerede ændring en klar indikation af større mængder af PC-produktet ved kortere mærkningsperioder i både malat og aspartat.

Flere beviser for PC-aktivitet i subspektra af uracil

I de novo pyrimidinsyntese dannes uracil fra aspartat via carbamoyl-aspartat, orotat og dihydroorotat. Derfor bør mærkningsmønstre i aspartat afspejles i pyrimidinringens signaler. Yderligere fil 2: Figur S2 viser forventede mærkningsinkorporationer for uracil. Når uracilbasen i UDP syntetiseres fra aspartat, er bestemmelsen af 13C’erne som følger: C1, C2 og C3 i aspartat bliver henholdsvis C10, C11 og C12 i UDP, mens C4 går tabt (se supplerende fil 2). I HSQC-spektre er kun C11 og C12 i stand til at blive direkte observeret, da C10 ikke har en tilknyttet proton.

For glukosemærkede prøver vil det PC-afledte aspartat blive C2C3-mærket. Dette omdannes til et mærket C11C12-fragment i UDP. PDH-afledt aspartat kan imidlertid mærkes ved C1C2 eller C3C4. Dette omdannes til henholdsvis C10C11 eller et isoleret C12 i uracil. Derfor er spektrer af C12 indikative for relative mængder af PC vs. PDH-aktivitet; PC giver en doublet for C12, mens PDH giver en singlet ved C12.

Alle spektrer viste både singlet- og doubletsignaler ved C12 (fig. 3). Intensiteten af doubletten i forhold til singletten ændrede sig imidlertid mellem 3 og 24 timers data med en faktor tre, hvilket igen indikerer et skift fra PC- til PDH-medieret mærkning med tiden. Det billede, der tegner sig af flere metabolitter, er, at der er parallel aktivitet af både PC og PDH, men PC-produktet kanaliseres primært til produkter, der er direkte knyttet til oxaloacetat, hvilket giver den høje observerede mængde PC-produkt i disse metabolitter i en kortvarig eksponering. Kun ved længere mærkningsperioder observeres PDH-produktet i den venstre gren af Krebs-cyklus.

BaP-induceret malonat er afledt af downstream PC-aktivitet i K562-celler

Vi har vist, at malonat kan dannes fra oxaloacetat ved kemisk omdannelse under påvirkning af hydrogenperoxid og foreslog i vores tidligere undersøgelse, at malonatakkumulering som reaktion på BaP-behandling blev drevet af behandlingsinduceret forhøjelse af ROS, der virker på oxaloacetat . Prøverne blev tilsat malonat for at bekræfte vores tildeling af malonatmethylen-1H/13C-resonanserne i HSQC-spektre (se yderligere filer 3 og 4). Efterfølgende har vores sporstofbaserede tilgang i denne undersøgelse givet os mulighed for at overveje oprindelsen af det observerede malonat.

Som vist i Fig. 4a ville ROS-afledt malonat, der stammer fra oxaloacetat, der var blevet dannet direkte fra pyruvat ved PC-aktivitet ved hjælp af glukose som næringskilde, forventes at blive mærket i positionerne C1 og C2. I den alternative situation, hvor PDH-aktivitet omdanner pyruvat til acetyl-coA ved indgangen til Krebs-cyklus, ville ROS-medieret omdannelse af det resulterende oxaloacetat til malonat forventes at give anledning til to produkter med mærkning i C1-positionen eller i C1- og C2-positionen i et 1:1-forhold, fordi Krebs-cyklusen passerer gennem symmetrisk succinat og fumarat (se også fig. 1).

Figur 4b viser et repræsentativt 1D-snit fra HSQC-spektre, der stammer fra 24 timer BaP-behandlede glukosemærkede celler, og viser tydeligt den lægemiddelinducerede generering af et stærkt malonatsignal. I de tilsvarende HSQC-spektre fra 24 timer BaP-behandlede glukose-mærkede celler observerede vi en klar doublet (fig. 4c vist som røde toppe) med en opdeling på 58 Hz, der indikerer en mærket CH2-gruppe koblet til et carboxylsyrekulstof. Dette er en klar indikation af et C1,C2 (eller C2,C3)-mærket malonat med mærkning i kun den ene af de to carboxylsyregrupper. Malonat mærket i alle tre positioner, som kan opstå ved flere gange at have passeret Krebs-cyklus, ville forventes at vise en triplet ved C2 i 13C-dimensionen af HSQC-spektre, da i det mindste en vis procentdel ville være mærket i begge COO-grupper (AX2-koblingsmønster). Derfor er fraværet af et centralt signal i HSQC i høj grad et tegn på, at malonat stammer fra PC-aktivitet opstrøms. Fraværet af malonat, der stammer fra flere Krebs-cyklusser og PDH-aktivitet, understøttes også af det faktum, at malonat, der stammer fra 24 timers mærkning af BaP-behandlede celler med glukose, kun viste en singlet (Fig. 4c vist som blå top).

For yderligere at bevise, at lægemiddelinduceret malonat stammer fra PC-aktivitet nedstrøms, erhvervede vi 13C-1D-spektra, hvor vi kunne observere malonats COO-resonanser direkte (Fig. 4d). Et referencespektrum af 10 mM malonsyre i den samme (pH 7) buffer som anvendt til celleekstrakter bekræftede frekvensen af COO-resonansen (Fig. 4d).

PC-medieret mærkning forventes at give en doublet ved C1 (hidrørende fra malonat), hvorimod PDH-medieret mærkning forventes at give en 50:50 blanding af en doublet hidrørende fra malonat og en singlet hidrørende fra malonat (Fig. 4a). Selv om de afledte spektrer var støjende selv efter 24 timers registrering, viste de afledte spektrer en klar doublet uden noget restsignal i midten (Fig. 4d), hvilket bekræfter, at det PC-afledte mærkningsprodukt er dominerende. Heraf konkluderer vi, at malonat faktisk stammer fra ROS-medieret omdannelse af oxaloacetat, der udelukkende eller i det mindste overvejende stammer fra PC-aktiviteten, og at der ikke er noget bidrag fra et muligt PDH-produkt, selv efter en mærkningsperiode på 24 timer. Kontrolforsøg med glutamin som kulstofkilde viste kun en minimal inkorporering af mærket i malonat. Det blev vist, at malonat produceret fra glukose overvejende blev mærket via PC. Tilsammen tyder disse to kendsgerninger stærkt på, at malonat overvejende produceres fra glukose via glykolyse og PC-medieret indgang af pyruvat i TCA-cyklus.

Evidens for parallel PDH-aktivitet

Tabel 1 sammenligner 1 J CC-koblingskonstanter og multiplet-intensitetsmønstre set i de 3 og 24 h mærkede datasæt. I både 3- og 24-h-datasættene er mærkningen ved glutamats C4 meget større end mærkningen ved C4, og den opsplitning, der ses ved C4, indikerer kobling til C5. Dette tyder stærkt på, at PDH-medieret mærkning er dominerende for glutamat på begge tidspunkter. Citrat C2 er opdelt ved en stor kobling til C1, hvilket igen stærkt tyder på, at PDH-medieret mærkning er dominerende. Disse mærkningsmønstre viser en klar dominans af PDH-produkter for den højre gren af Krebscyklusen, der fører fra citrat til glutamat.

Computationel multipletanalyse

Snit fra 1H-13C-HSQC blev også analyseret kvantitativt ved simulering af 13C-NMR-spektre for en blanding af forskellige isotopomerer ved hjælp af pyGamma-softwaren fra NMRLab-softwaren . For glutamat bekræftede multipletanalysen, at PDH-medieret mærkning var dominerende ved både 3 og 24 timer uanset BaP-behandling. For aspartat bekræftede multipletanalysen, at der var et skift fra PC-medieret mærkning ved 3 h til PDH-medieret mærkning ved 24 h. De simulerede spektrer er vist i Additional file 5: Figur S4, og tabel 2 bekræfter de kvalitative resultater for aspartat og glutamat.