Bakteriestammer og vækstbetingelser

Bakteriestammer er anført i Supplerende tabel 2. Escherichia coli blev dyrket på Luria Broth (LB)-plader eller i flydende LB-medium, suppleret med 200 µg ml-1 erythromycin ved 37 °C. Transformation af E. coli med plasmid-DNA blev udført ved hjælp af kemisk kompetente celler. S. pneumoniae serotype 2 D39 og serotype 4 TIGR4 og deres isogene mutanter blev dyrket på Columbia blodagarplader (Oxoid) indeholdende erythromycin (5 µg ml-1) og/eller chloramphenicol (5 µg ml-1), eller dyrket i Todd-Hewitt-bouillon suppleret med henholdsvis 0,5 % gærekstrakt (THY; Roth) eller kemisk defineret medium (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences). Dyrkning af pneumokokker på blodagar eller i flydende kulturer blev udført ved 37 °C og 5 % CO2 uden omrøring.

Mutantkonstruktion

Til konstruktion af pneumokok-tacL-mutanterne i D39 og TIGR4 blev et DNA-fragment bestående af S. pneumoniae D39 spd_1672-genet og dets op- og nedstrøms flankerende regioner blev amplificeret ved PCR fra genomisk DNA ved hjælp af primer SPD1672_OLup_for og SPD1672_OLdwn_rev (primere er anført i supplerende tabel 2). De oprensede PCR-produkter blev klonet ind i pUC18, og E. coli DH5α kemisk kompetente celler blev transformeret med det resulterende plasmid. Det rekombinante plasmid pNH1, der indeholder den ønskede DNA-indsats, blev oprenset og anvendt som skabelon for en omvendt PCR-reaktion med primer InvrevKpnISPD1672 og InvforPstISPD1672. Den slettede gensekvens blev erstattet af et ermB-gen, der blev amplificeret ved PCR fra vektor pTP1 ved hjælp af primer InvrevKpnIErm og InforPstIErm. Det endelige rekombinante plasmid blev anvendt til at transformere og mutagenisere pneumokokker. Transformationseffektiviteten blev vurderet ved hjælp af det endelige rekombinante plasmid i forhold til et andet gen-deletionsplasmid (til deletion af cbpL-genet) i S. pneumoniae D39Δcps 44. Det er bemærkelsesværdigt, at transformationseffektiviteten derved blev væsentligt forøget for tacL-deletionen (2,8 kolonier pr. ng plasmid for cbpL mod 29,8 kolonier pr. ng plasmid for tacL).

Isogene mutanter blev suppleret med et pBAV1CpE-baseret in trans-system; pBAV1CpE blev modificeret fra pBAV1K-T5-gfp45 ved at udskifte kanamycinresistensgenet med et kloramfenikolresistensgen og T5-promotoren med en erythromycinpromotorregion (pE), som omfatter ribosombindingsstedet og startkodonet. Det komplette spd_1672-gen blev amplificeret ved PCR ved hjælp af primer 1672_com_for og Spd1672_com_rev, og det oprensede fragment blev klonet ind i pBAV1CpE. Det resulterende plasmid pBAV-tacL blev anvendt til at transformere isogene tacL-mutanter. Deletionen af tacL samt in trans-komplementeringen blev verificeret ved hjælp af qRT-PCR (supplerende fig. 3).

Real-time kvantitativ PCR (qRT-PCR)

Indkapslet og ikke-indkapslet D39-wildtypestamme, tacL-deficient mutant og komplementeret mutant blev dyrket i THY indtil midten af logfasen (A 600 = 0,35-0,45) og høstet til RNA-isolering ved hjælp af EURx GeneMatrix Universal RNA-rensningssæt (roboklon). RNA-kvaliteten blev kontrolleret ved agarosegelelektroforese og standard-PCR ved hjælp af primer EnoRT_F og EnoRT_R (se supplerende tabel 2). Syntesen af cDNA blev udført ved hjælp af SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher) og hexameric_random-primere (GE Healthcare) i henhold til producentens anvisninger. Kvaliteten af cDNA blev kontrolleret ved PCR ved hjælp af primer EnoRT_F og EnoRT_R, og koncentrationen blev målt med nanodrop. cDNA blev opbevaret ved -20 °C indtil yderligere undersøgelser. Til qRT-PCR-eksperimenterne blev StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) og SYBR® Green Master Mix (Biorad) anvendt i kombination med tacL-specifikke primere samt enolase-primere som kontrol (se supplerende tabel 2). StepOne-softwaren (v. 2.3, Life Technologies) blev anvendt til dataanalyse. De endelige resultater præsenteres som størrelsen af fluorescens (ΔRn) plottet mod PCR-cyklusnumre.

Sequencelering og bioinformatisk analyse

Sequencelering: 1 ng oprenset kromosomalt DNA fra S. pneumoniae-stammerne D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), og TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) blev anvendt til at fremstille individuelle biblioteker ved hjælp af og efter Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kit. En Agilent Technology 2100 Bioanalyzer tjente til at verificere tagmenteringen og den endelige fragmentstørrelsesfordeling af biblioteket på en højfølsom DNA-chip. Der blev anvendt AMPure XP-perler til oprensning af DNA-biblioteket. Det endelige poolede bibliotek blev anvendt på et MiSeq Reagent v3 600cycle-kit og sekventeret på et MiSeq-system som 300-cyklus parrede-end-kørsel. Den endelige bibliotekspool blev tilsat et 5 % PhiX-kontrolbibliotek. Der blev opnået en klyngetæthed på 847 ± 25 (K mm-2) med 96,46 ± 1,48 % af klyngerne, der passerede filterspecifikationerne. 20,3 mio. læsninger (94,7 %) af 21,1 mio. samlede læsninger bestod filterspecifikationerne, hvilket resulterede i 12,52 Gbp sekvensdata. Indekslæsningerne var jævnt fordelt over de seks individuelle prøver. De genererede FASTQ-filer blev underkastet yderligere bioinformatisk analyse som beskrevet nedenfor.

SNP-detektion og annotation: SNP-detektion blev udført for S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL individuelt ved hjælp af “snippy” (https://github.com/tseemann/snippy; parameter: minimumsandel for variantbevis: 60%; minimumsdækning af variantstedet: ≥5 sekvenser læser). Som referencegenom blev Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) eller Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3) anvendt.

De resulterende SNP’er for hver gruppe af mutanter (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) og (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) blev slået sammen og sammenlignet. Genomdækningen blev estimeret med qualimap46 ved hjælp af de samme referencegenomer som til SNP-detektion.

Isolering af pneumokokteichoiske syrer

Ekstraktion og isolering af LTA: LTA-oprensning blev grundlæggende udført som beskrevet andetsteds7, men for at optimere udbyttet af pnLTA er en specifik detalje blevet ændret. Pneumokokcelleceller blev resuspenderet i citratbuffer (50 mM, pH 4,7) og opløst tre gange med fransk presse (Constant Cell Disruption System, Serial No. 1020) ved 10 °C og et tryk på 20 kPSI. SDS blev tilsat til en slutkoncentration på 4 % til de kombinerede supernatanter. Opløsningen blev inkuberet i 30 minutter ved 100 °C og blev herefter omrørt natten over ved stuetemperatur. Opløsningen blev centrifugeret ved 30 000×g i 15 min. ved 4 °C. Pelleten blev vasket fire gange med citratbuffer under de samme centrifugeringsbetingelser som ovenfor. De kombinerede LTA-holdige supernatanter og det resulterende sediment, der indeholder det rå PGN-WTA-kompleks, blev lyofiliseret separat. De resulterende faste stoffer blev begge vasket fem gange med ethanol (centrifugering: 20 min., 20 °C, 10 650×g) for at fjerne SDS og blev lyofiliseret (hvilket resulterede i pellet A indeholdende LTA og pellet B indeholdende PGN-WTA-komplekset). Til isolering af LTA blev pellet A resuspenderet i citratbuffer og ekstraheret med en lige stor mængde butan-1-ol (Merck) ved stuetemperatur og under kraftig omrøring. Faserne blev adskilt ved centrifugering ved 2 100×g i 15 min. ved 4 °C. Den vandige fase (indeholdende LTA) blev opsamlet, og ekstraktionsproceduren blev gentaget to gange med den organiske fase plus interfasen. De kombinerede vandige faser blev lyofiliseret og efterfølgende dialyseret i 5 dage ved 4 °C i 50 mM ammoniumacetatbuffer (pH 4,7; 3,5 kDa cutoff-membran); bufferen blev skiftet hver 24. time. Den resulterende rå LTA blev yderligere oprenset ved hydrofob interaktionskromatografi (HIC) udført på en HiPrep Octyl-Sepharose-kolonne (GE Healthcare; 16 × 100 mm, sengvolumen 20 ml). Det rå LTA-materiale blev opløst i så lidt startbuffer (15 % propan-1-ol (Roth) i 0,1 M ammoniumacetat (pH 4,7)) som muligt og centrifugeret ved 13 000×g i 5 minutter ved stuetemperatur, hvorefter den resulterende supernatant blev frysetørret. Det LTA-holdige pellet blev opløst i HIC-startbufferen i en koncentration på 30 mg ml-1 og renset ved HIC ved hjælp af en lineær gradient fra 15 til 60 % propan-1-ol (Roth) i 0,1 M ammoniumacetat (pH 4,7). LTA-holdige fraktioner blev identificeret ved hjælp af en fotometrisk fosfatprøve47. De fosfatholdige fraktioner blev kombineret, lyofiliseret og vasket med vand ved frysetørring for at fjerne resterende buffer.

Ekstraktion og isolering af WTA: WTA-isolering og -ekstraktion blev udført som beskrevet andetsteds11 , men med mindre ændringer. Pellet B (indeholdende det rå PGN-WTA-kompleks), som opstod under LTA-isolering, blev resuspenderet ved en koncentration på 10 mg ml-1 i 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) indeholdende 20 mM MgSO4. DNase A og RNase I blev tilsat til slutkoncentrationer på henholdsvis 10 og 50 µg ml-1. Suspensionen blev omrørt i 2 timer ved 37 °C. Derefter blev der tilsat 10 mM CaCl2 og trypsin (100 µg ml-1), og omrøringen blev fortsat natten over ved 37 °C. SDS i en slutkoncentration på 1% blev tilsat, og blandingen blev inkuberet i 15 min. ved 80 °C for at inaktivere enzymerne. Cellevæggen blev genvundet ved centrifugering i 45 min. ved 130.000×g ved 25 °C. Den resulterende pellet blev resuspenderet i 0,8 ml 8 M LiCl pr. 1 ml oprindeligt anvendt Tris-HCl-opløsning og inkuberet i 15 min. ved 37 °C. Efter endnu en centrifugering under de samme betingelser som ovenfor blev pellen resuspenderet i 1 ml 10 mM ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA, pH 7,0) pr. ml af den oprindeligt anvendte Tris-HCl-opløsning, og denne prøve blev inkuberet ved 37 °C i 15 min. Pelleten blev vasket to gange med vand. Til sidst blev pelleten resuspenderet i 2-4 ml vand og frysetørret, hvorved det rensede PGN-WTA-kompleks fremkom. Afhængigt af det specifikke forskningsspørgsmål blev der efterfølgende udført yderligere kemiske eller enzymatiske behandlinger.

Kemiske og enzymatiske behandlinger

Hydrazinbehandling af LTA: Renset LTA blev opløst i en koncentration på 5 µg µl-1 i vandfri hydrazin (N2H4; ICN Biomedicals), inden det blev inkuberet i 1 h ved 37 °C under omrøring. Reaktionen blev slukket ved at tilsætte samme mængde acetone og tørret under en nitrogenstrøm; tørringstrinnet blev gentaget to gange. Derefter blev den rå de-O-acylerede LTA renset ved gelpermeationskromatografi (GPC) på en Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; kolonnestørrelse: 1,5 × 120 cm; buffer:

Enzymatisk fordøjelse af PGN-WTA-komplekset: For at fjerne alle aminosyrer fra PGN blev PGN-WTA-komplekset opløst i 50 mM Tris-HCl (pH 7,0; 10 mg ml-1) og behandlet med pneumokok LytA-amidase som beskrevet andetsteds11. Rekombinant His-markeret LytA-amidase (10 µg LytA pr. mg) blev tilsat i tre alikvotes efter 0, 24 og 48 timer for en samlet inkubationsperiode på 72 timer ved 37 °C. Derefter blev enzymet inaktiveret ved at koge i 5 minutter ved 100 °C. Efter centrifugering (25 000×g, 15 min, 20 °C) blev supernatanten opsamlet og lyofiliseret. Det rå LytA-behandlede PGN-WTA-kompleks blev yderligere oprenset ved GPC på en Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; kolonnestørrelse: 1,5 × 120 cm; buffer: 150 mM ammoniumacetat (pH 4,7)) kolonne. Det opnåede materiale med høj molekylvægt (~12 mg) blev yderligere fordøjet med lysozym (200 µg; Sigma) og mutanolysin (200 µg; Sigma) i en 800 µl reaktionsblanding indeholdende natriumphosphat (20 mM; pH 4,8) og natriumazid (0,02%) ved 37 °C natten over. Enzymerne blev inaktiveret ved opvarmning ved 100 °C i 5 minutter. Det opløselige materiale blev genvundet ved centrifugering (18 000×g, 10 min, 20 °C) og lyofiliseret. Isolering af pnWTA bundet til små PGN-fragmenter blev opnået ved en afsluttende GPC under anvendelse af ovennævnte betingelser.

NMR-spektroskopi

NMR-spektroskopiske målinger blev udført i D2O ved 300 K på en Bruker AvanceIII 700 MHz (udstyret med en omvendt 5 mm quadruple-resonans Z-grad cryoprobe). Deutererede opløsningsmidler blev købt hos Deutero GmbH (Kastellaun, Tyskland). Acetone blev anvendt som en ekstern standard til kalibrering af 1H- (δH 2,225) og 13C- (δC 30,89) NMR-spektre. 31P NMR-spektre (δP 0,0) blev kalibreret med 85 % fosforsyre i D2O som ekstern standard. 1H NMR-tilknytninger blev bekræftet ved todimensionale 1H, 1H COSY- og TOCSY-eksperimenter, og 13C NMR-tilknytninger blev angivet ved todimensional 1H, 13C HSQC, baseret på 1H NMR-tilknytningerne. Interresidual konnektivitet og yderligere beviser for 13C-tilknytningen blev opnået ved hjælp af todimensionale 1H, 13C HMBC- og 1H, 13C HSQC-TOCSY-eksperimenter. Phosphatgruppekonnektivitet blev tildelt ved todimensional 1H, 31P HMQC og 1H, 31P HMQC-TOCSY. Alle data blev erhvervet og behandlet ved hjælp af Bruker TOPSIN V 3.0 eller højere.

Massespektrometri

For at analysere pnWTA bundet til små PGN-fragmenter blev elektrosprayionisering fourier-transform ioncyklotronresonansmassespektrometri (ESI-FT-ICR-MS) udført på et 7 Tesla APEX Qe-instrument (Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland) ved hjælp af negativ-ion-tilstand og en vand/propan-2-ol/7 M triethylamin/eddikesyre-blanding (50:50:0.06:0,02 v/v/v/v/v/v) som opløsningsmiddel, som tidligere beskrevet6. MS-analyse af hydrazinbehandlet LTA blev udført på en Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bremen, Tyskland) i negativ-ion-tilstand med det samme opløsningsmiddel. Der blev anvendt en Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, USA) ionkilde med en sprayspænding indstillet til -1,1 kV. Masseskalaen blev kalibreret eksternt med glykolipider af kendt struktur, og alle spektrer blev ladningsdekonvolueret. De angivne massetal henviser til den monoisotopiske masse af de neutrale molekyler.

Elektronmikroskopi

Feltemissions-scanningselektronmikroskopi: Bakterier blev fikseret i vækstmediet med 5 % formaldehyd og 2,5 % glutaraldehyd i 1 time på is og vasket med HEPES-buffer (HEPES 0,1 M, 0,09 M saccharose, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9). En alikvot på 50 µl af den fikserede bakterieopløsning blev anbragt på poly-l-lysinbelagte dækglas og fik lov til at sætte sig i 10 minutter. Efter fiksering med 2 % glutaraldehyd i PBS i 5 min. ved stuetemperatur blev dækglassene vasket med TE-buffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9), inden de blev dehydreret i en gradueret serie acetone (10, 30, 50, 70, 90 og 100 %) på is i 10 min. for hvert trin. Prøverne i 100 % acetone-trinnet fik lov til at nå stuetemperatur før endnu et skift i 100 % acetone før kritisk punkttørring med flydende CO2 (CPD 30, Balzers, Liechtenstein). De tørrede prøver blev dækket af en palladium-guldfilm ved sputterbelægning (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein), inden de blev undersøgt i et feltemissions-scanningselektronmikroskop Zeiss Merlin (Oberkochen, Tyskland) ved hjælp af HESE2 Everhart Thornley SE-detektoren og in-lens SE-detektoren i et 25:75-forhold ved en accelerationsspænding på 5 kV.

Transmissionselektronmikroskopi: Bakterierne blev fikseret som ovenfor og yderligere fikseret med osmiumtetroxid (1 % i HEPES-buffer) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med HEPES-buffer blev prøverne dehydreret med 10, 30 og 50 % acetone på is, inden de blev inkuberet i 70 % acetone med 2 % uranylacetat natten over ved 7 °C. Prøverne blev yderligere dehydreret med 90 og 100 % acetone på is, fik lov til at nå stuetemperatur og blev yderligere dehydreret med 100 % acetone, hvorefter de blev skiftet til 100 % ethanol. Efterfølgende blev prøverne infiltreret med den aromatiske akrylharpiks LRWhite. Efter polymerisering i 2 dage ved 50 °C blev ultratynde snit skåret med en diamantkniv, samlet på butvar-belagte 3000 mesh-gitre og modfarvet med 4 % vandigt uranylacetat i 3 minutter. Prøverne blev afbildet i et Zeiss TEM 910 ved en accelerationsspænding på 80 kV og ved kalibrerede forstørrelser.

Kontrast og lysstyrke blev justeret med Adobe Photoshop CS3.

Generering af antistoffer

Polyklonale antistoffer mod analyserede CBP’er blev opdrættet i mus ved hjælp af rutinemæssige immuniseringsprotokoller. Kort fortalt blev CD-1-mus immuniseret intraperitonealt med 20 µg rekombinant protein og Freund’s ufuldstændige adjuvans (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) (50:50 v/v). På dag 14 og 28 blev musene boostet med 20 µg protein og Freund’s ufuldstændig adjuvans (50:50 v/v). Musene blev afblødt på dag 42, og polyklonalt IgG blev oprenset fra serum ved hjælp af protein A-Sepharose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland). Antistoffer er anført i supplerende tabel 2.

Flowcytometri

S. pneumoniae D39 vild type, dens isogene tacL-mutant og den komplementerede mutant blev dyrket i THY-medium til midten af logfasen, høstet ved 3 275×g i 6 min. og vasket med PBS (pH 7,4). Til kvantificering af kapselindholdet blev en 100 µl suspension indeholdende 4 × 108 bakterier inkuberet med anti-capsulære polysaccharid antisera (SSI Type serum 2, Statens Serum Institut) (1:500 i PBS) i 30-45 min. ved 37 °C og 5 % CO2 i 96-hulsplader (U-bund, Greiner Bio-One). Efter vask blev prøverne inkuberet med et sekundært gede-anti-kanin-IgG-koblet Alexa488-mærket antistof (Invitrogen) (1:500 i PBS, 30-45 min, 37 °C). Efter vask med PBS blev bakterierne fikseret med 1 % formaldehyd natten over ved 4 °C.

Mængden af CBP’er samt mængden af teichoiske syrer i ikke-indkapslede D39-wildtype-, mutant- og komplementerede D39-stammer blev målt ved flowcytometri efter fiksering med 1 % formaldehyd i 1 time ved 4 °C. To hundrede µl suspensioner indeholdende 8 × 108 bakterier blev inkuberet med specifikke polyklonale antistoffer mod forskellige CBP’er (1:500 i PBS) eller med henblik på kvantificering af TA’er med antistoffer mod P-Cho (TEPC-15) eller Forssman-antigen (15 min. ved 37 °C og 5 % CO2) i 96-hulsplader (U-bund, Greiner Bio-One). Efter vask blev prøverne inkuberet med et sekundært gedeanti-IgG-koblet Alexa488-mærket antistof (Invitrogen) (15 min., 37 °C). Fluorescensen blev bestemt ved hjælp af en FACS Calibur™ (BD Biosciences).

Immunoblot-analyse

S. pneumoniae D39, dens isogene tacL-mutant og den komplementerede mutant blev dyrket i THY-medium, indtil der blev opnået en A 600 på 0,35-0,45, høstet ved centrifugering ved 3270×g ved 4 °C i 6 min. og resuspenderet i 1 ml PBS-buffer ved pH 7,4. I alt 2 × 108 celler pr. brønd blev belastet og kørt på en 12 % SDS-PAGE, inden de blev overført til en nitrocellulosemembran ved semidry blotting. Membranerne blev blokeret i 2 timer ved stuetemperatur med 5 % skummetmælk (Roth) og Tris-buffered saline (TBS; pH 7,4) og inkuberet natten over ved 4 °C med musepolyklonale antistoffer mod forskellige CBP’er (1:500 i 5 % skummetmælk + TBS 0,01 % Tween (T-TBS)). Et kanin-polyklonalt antistof mod enolase (1:25.000 i 5 % skummetmælk + T-TBS) blev anvendt som belastningskontrol. Membranerne blev vasket med T-TBS, CBP’er blev påvist med det sekundære fluorescensmærkede IRDye® 800CW. Gede α-mus IgG og enolase blev påvist med det fluorescensmærkede IRDye® 680RD. Gede α-kanin-IgG-antistof blev påvist ved inkubation med det relevante antistof (1:15 000 i 5 % skummetmælk i T-TBS) i 45 minutter i mørke ved stuetemperatur; membranerne blev vasket med T-TBS og til sidst én gang med TBS. Scanning af membranerne blev udført ved hjælp af en Odyssey® CLx (LI-COR) scanner.

Triton X-100-induceret autolyseassay

S. pneumoniae D39 wild-type, mutant og komplementeret stamme blev dyrket i THY-medium til mid-log fase, høstet ved 3275×g i 6 min og vasket med PBS (pH 7,4). En 1 ml suspension indeholdende 1 × 109 bakterier blev inkuberet med en slutkoncentration på 0,01 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) og inkuberet ved 37 °C. Bakteriecellelysis blev overvåget ved at måle absorbansen ved 600 nm på foruddefinerede tidspunkter.

Epithelial adherence assay

Pneumokokkernes adhærens til epithelceller blev analyseret med humane A549-celler (ATCC® CCl-185TM) som beskrevet48. Kort fortalt blev konfluente epitelceller, dyrket på glascoverlips (Hartenstein; i 24-hulsplader, ~1 × 105 celler pr. brønd), inokuleret med 5 × 106 midt eksponentielt dyrkede pneumokokker og inkuberet i infektionsmedium (DMEM (HyClone™) + 1 % varmeinaktiveret føtal bovin serum (FBS)) ved 37 °C og 5 % CO2. Efterfølgende blev cellerne vasket tre gange med fosfatbufferet saltvand indeholdende 1 % FBS (Gibco) for at fjerne ubundne bakterier. Derefter blev bakterierne fikseret med PBS indeholdende 1 % para-formaldehyd (PFA, Roth).

Immunofluorescensmikroskopi

Fikserede pneumokokker, der var bundet til A549-celler, blev vasket tre gange med PBS og blokeret i 1 time ved stuetemperatur med PBS + 10 % FBS. Efter vask blev prøverne inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med et polyklonalt antistof (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) mod pneumokokker (fremstillet i kanin mod varmeinaktiveret S. pneumoniae TIGR4 og D39). Som sekundært antistof blev der anvendt fluorescensmærket Alexa-Fluor488 gede-anti-kanin-antistof (Abcam) (1:500, 1 time, stuetemperatur). Bakterieadhærens blev overvåget for mindst 20 celler pr. klasse dækglas ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Hvert forsøg blev gentaget tre gange i to eksemplarer. Alle data er rapporteret som gennemsnit ± s.d. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af den uparrede tosidede Student’s t-test. I alle analyser blev en p-værdi på <0,05 betragtet som statistisk signifikant.

Fagocytoseeksperimenter

Antibiotisk beskyttelsesassay: Et konfluent lag af monocytiske THP-1-celler (ATCC® TIB-202TM), der var dyrket i 24-hulsplader (3 × 105 celler pr. brønd i RPMI-1640 (HyClone™) suppleret med 10 % varmeinaktiveret føtal bovin serum (FBS, Gibco)), blev differentieret til fagocytter ved tilsætning af 200 nmol ml-1 phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA, Sigma-Aldrich) og inkuberet i 48 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Derefter blev THP-1-cellerne vasket med RPMI-1640 suppleret med 10 % varmeinaktiveret FBS og inkuberet i yderligere 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Forud for infektion blev pneumokokker dyrket i THY til mid-log-fase (A 600 = 0,35-0,45), centrifugeret og vasket med infektionsmedium (RPMI-1640 suppleret med 1 % varmeinaktiveret FBS). THP-1-celler blev vasket og inficeret med pneumokokker i 500 µl infektionsmedium. Infektionen blev synkroniseret ved centrifugering (2 min, 300×g) for at initiere en samtidig kontakt mellem bakterier og fagocytter. Derefter blev cellerne inkuberet ved 37 °C og 5 % CO2 i forskellige tidsperioder. Efter infektionen blev cellerne vasket med infektionsmedium og inkuberet med Penicillin G (100 enheder ml-1, Sigma-Aldrich) og Gentamicin (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2 for at dræbe ekstracellulære bakterier. Derefter blev fagocytterne vasket og lyseret med 1 % saponin (Sigma-Aldrich) for at frigøre intracellulære pneumokokker. Kolonidannende enheder (cfu) af intracellulære bakterier blev bestemt ved at udplante bakterier i passende fortyndinger på blodagarplader (Oxoid)49. Den tidsafhængige aflivning af intracellulære pneumokokker blev vurderet ved at aflive ekstracellulære pneumokokker ved hjælp af antibiotika som beskrevet ovenfor. Herefter blev fagocytter yderligere inkuberet i infektionsmedium i forskellige tidsperioder (0-3 timer). Intracellulære bakterielle cfu blev overvåget som beskrevet ovenfor. Alle eksperimenter blev gentaget fire gange som dubletter. Data blev normaliseret i antibiotikabeskyttelsesassaysene til multipliciteten af infektion (MOI) eller i den tidsafhængige aflivning til genvundne bakterier på tidspunktet 0 h. Alle assays blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA med Bonferroni-korrektion.

Dobbelt immunofluorescensfarvning og mikroskopi

PMA-differentierede THP-1-celler (3 × 105 celler pr. brønd) blev dyrket på sterile glascoverlips (12 mm, Hartenstein) og inficeret med pneumokokker som beskrevet ovenfor. Efter infektion blev THP-1-cellerne vasket med infektionsmedium og fikseret med 4 % paraformaldehyd (Roth) natten over ved 4 °C. Glascoverlips blev vasket med PBS og blokeret med PBS + 10 % varmeinaktiveret FBS i 1 time. Efter vask blev ekstracellulære bakterier farvet ved hjælp af et polyklonalt α-pneumokokker IgG (1:500) og et Alexa-Fluor488-mærket sekundært gede α-kanin-IgG (1:500, Abcam) i 30 min. ved stuetemperatur. Glascoverlips blev vasket tre gange med PBS efter permeabilisering af THP-1-celler med 0,1 % Triton X-100 i PBS (10 min, stuetemperatur). Efter vask blev intracellulære pneumokokker farvet ved hjælp af et polyklonalt α-pneumokokokker IgG (1:500) og et sekundært Alexa-Fluor568-mærket ged α-kanin-IgG (1:500, Abcam) i 30 min ved stuetemperatur. Eksperimenterne blev gentaget tre gange som dubletter. Til statistisk analyse blev 50 celler pr. glascoverlip analyseret for antallet af intracellulære bakterier. Data blev normaliseret i forhold til MOI. Alle assays blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA med Bonferroni-korrektion. I alle analyser blev en p-værdi på <0,05 betragtet som statistisk signifikant.

Cellelinjer

Alle cellelinjer, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev købt hos ATCC (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202) og er blevet testet for at være mycoplasma-negative ved PCR og scanningelektronmikroskopi.

Akut musepneumoni og systemisk infektionsmodel

Otte- til 10 uger gamle hun-CD-1-mus (outbred, Charles River, Sulzfeld, Tyskland) blev intranasalt inficeret med bioluminescerende pneumokokker som beskrevet for nylig50. Kort fortalt blev pneumokokkerne dyrket til midten af den eksponentielle fase (A 600 = 0,35) i THY-medium indeholdende 10 % varmeinaktiveret føtal bovin serum. Efter centrifugering blev infektionsdosis (20 µl) justeret til ~2,5 × 107 cfu i PBS (pH 7,4). Til nasal infektion blev musene bedøvet ved intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Tyskland; Rompun, Provet AG, Lyssach, Tyskland), og bakterierne blev indgivet drypvis i næseborene. Infektionsdosisens cfu blev bekræftet ved udpladning af serielle fortyndinger af inokulumet på blodagarplader. Musene blev overvåget med hensyn til overlevelse og fotograferet for bioluminescens med forudvalgte intervaller ved hjælp af IVIS® Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA). Til den systemiske infektionsmodel blev en infektionsdosis på 3 × 103 cfu administreret intraperitonealt i et volumen på 200 µl PBS (pH 7,4). Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de tyske bestemmelser fra Society for Laboratory Animal Science (GV-SOLAS) og den europæiske sundhedslov fra Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Alle forsøg blev godkendt af Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Tyskland, tilladelse nr. 7221.3-1-056/16-1).

Datatilgængelighed

Rå FASTQ-filer indeholdende S. pneumoniae genomiske sekvensdata blev indsendt til EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) og gemt i Short Read Archive (SRA) under undersøgelsens tiltrædelsesnummer RJEB18558. Alle andre relevante data, der understøtter undersøgelsens resultater, er tilgængelige i denne artikel og dens supplerende informationsfiler eller kan fås ved henvendelse til de tilsvarende forfattere.