2.2 Produktionsstrategier for Levan

Levan syntetiseres som et exopolysaccharid (EPS) i den ekstracellulære matrix af bakterier fra forskellige slægter, såsom Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus og Zymomonas (Sarilmiser et al.., 2015). Ud over disse ekstremofile levanproducenter rapporterede Poli et al. (2009) Halomonas sp. som en levanproducent. Yderligere undersøgelser af den potentielle anvendelse af Halomonas levan som et bioflocculerende middel (Sam et al., 2011), peptid- og proteinbaseret lægemiddelafgivelsessystem (Sezer et al., 2011, 2015), biokompatibel tynd (Sima et al., 2011, 2014), klæbende flerlagsfilm (Costa et al., 2013) og et heparinimiterende glykan (Erginer et al., 2016) blev undersøgt. Fig. 12.2 viser den generelle produktionsproces for mikrobielt levan.

Figur 12.2. Grundlæggende trin i downstream-forarbejdningen af levan.

Mikrobielle EPS’er produceres normalt i aerobe, nedsænkede fermenteringssystemer. Fermenteringsbetingelser som f.eks. beluftning, omrøring, pH, koncentration af opløst ilt, temperatur, mediesammensætning og bioreaktordesign kan bestemme produktets egenskaber og produktionsudbyttet. For at opnå en høj produktionskvalitet og et højt udbytte skal der derfor foretages en udførlig optimering af disse parametre for hver organisme (Öner et al., 2016). For eksempel undersøgte Srikanth et al. (2015) virkningerne af fermenteringsparametre, herunder indledende pH, levantilførsel, saccharosekoncentration, kvælstofkilde, inokulumkoncentration og dyrkningstid på levan-syntese ved hjælp af Acetobacter xylinum NCIM2526 som producentstamme. Optimale betingelser blev fastsat til henholdsvis 10, 50-60 og 1,49 g/L for kvælstof, saccharose og inokulum. Levanudbyttet steg markant efter de første 24 timer, og den maksimale levanproduktivitet blev opnået efter 122 timer, da den oprindelige pH-værdi blev sat til 6,8. En forøgelse af den oprindelige levantilførsel fra 0,1 til 0,4 g/L øgede levanudbyttet fra 1,22 til 1,65 g/L; alt over 0,4 g/L havde ingen yderligere forøgelse af udbyttet. Inokulumkoncentrationer på mellem 5 % (v/v) og 10 % (v/v) resulterede i en ændring i levanudbyttet som forventet, og det maksimale udbytte (1,46 g/L) blev opnået ved 7 % (v/v). Saccharosekoncentrationer fra 20 til 80 g/L påvirkede levanudbyttet. I intervallet 40-50 g/L blev produktionsudbyttet øget, i intervallet 70-80 g/L blev det reduceret, og i intervallet 20-40 g/L blev det ikke ændret.

Sarilmiser et al. (2015) undersøgte levanproduktion i en halofil mikroorganisme (Halomonas smyrnensis AAD6T) ved hjælp af forskellige stimulerende faktorer. For eksempel blev forskellige fodringsstrategier anvendt med forskellige tidsintervaller i et batch-bioreaktorsystem, og flere indledende betingelser blev testet i shake-kulturer. Blandt de forskellige pH- og saccharosekoncentrationer, der blev testet, blev det maksimale levanudbytte opnået ved pH 7 (1,345 g/L levan) og 50 g/L saccharose (1,320 g/L levan). Når kvælstof- og fosforbegrænsninger blev anvendt, faldt både levankoncentrationen og biomassen, mens Yp/x-værdierne steg. Kvælstofimpulsstrategier mindskede levan-syntesen på grund af den forlængede vækstperiode, saccharoseimpulsstrategier forbedrede cellevæksten og levan-produktionen betydeligt, og NaCl-impulsen havde ingen indvirkning på væksten. Interessant nok producerede kulturer, der blev dyrket i tilstedeværelse af borsyre, de højeste koncentrationer af levan (8,84 g/L) under kontrollerede bioreaktorforhold. Denne forbedring blev forklaret ved det biologiske fænomen kendt som quorum sensing (QS), hvor boratomer er involveret; et af de signalmolekyler, der er involveret i QS i H. smyrnensis AAD6T, blev senere identificeret som et C16-acylhomoserinelacton (Abbamondi et al., 2016).

Molekylvægten af levan er en afgørende faktor for dets anvendelighed i forskellige industrier, herunder fødevare-, kosmetik- og medicinalindustrien (Belghith et al., 1996). Bestemmelse af de optimerede betingelser for levanproduktion er afgørende for opnåelse af den ønskede molekylvægtforbindelse (Porras-Domínguez et al., 2015). For eksempel evaluerede Wu et al. (2013) subtile ændringer i produktionsprocessen for at opnå forskellige molekylvægte af levan i batch- og fed-batch-systemer, idet de anvendte Bacillus subtilis (natto) Takahashi som producentstamme. Når der blev anvendt høje (400 g/L) og lave (20 g/L) koncentrationer af saccharose, blev der opnået henholdsvis lavere og højere molekylvægt af levan. Denne lineære sammenhæng blev tilskrevet virkningen af saccharose på levansucraseenzymet. Forfatterne konkluderede, at levanens molekylvægt var afhængig af reaktionsbetingelserne, såsom pH, temperatur, omrøringshastighed og saccharose, idet sidstnævnte var den mest effektive faktor, der bestemte levanens molekylvægt.

Levanproduktion i immobiliserede cellesystemer er også fordelagtig, da sådanne systemer drager fordel af relativt nemme downstream-processer, høj volumetrisk produktivitet, avanceret proceskontrol og reduceret kontaminationsrisiko ved EPS-produktion (Ürküt et al., 2007). Implementering af denne gunstige metode til levanproduktion kan anvendes som et alternativ til batch-, fed-batch- og kontinuerlige processer (Öner et al., 2016). For eksempel testede Silbir et al. (2014) levanproduktion i batch- og kontinuerlige fermenteringssystemer ved hjælp af Zymomonas mobilis B-14023. Kontinuerlige fermenteringsproduktioner blev kørt i en packed-bed bioreaktor ved hjælp af Ca-alginat immobiliserede celler. Inkubationstid, indledende pH-værdi og substratkoncentration var de tre mest signifikante procesvariabler for produktion af levan i batch-systemer. Den højeste mængde levan (40,2 g/L) blev produceret, når gærekstrakt blev anvendt som organisk kvælstofkilde i shake-flask-kulturer. Desuden blev immobiliserede Z. mobilis-celler i det kontinuerlige fermenteringssystem anvendt med succes til levanproduktion. Ukontrollerbare fald i systemtrykket og forstyrrelse af Ca-alginat-gelperler var de største begrænsninger for længere fermenteringstider.

Trods mangfoldigheden af levanproducerende mikroorganismer er produktionsomkostningerne for levan-polysaccharid fortsat høje. Dette er sandsynligvis den største flaskehals for dets kommercialisering (Öner et al., 2016; Sarilmiser et al., 2015). Fermenteringsmedier udgør ca. 50 % af produktionsomkostningerne for en mikrobiel proces (Van Hoek et al., 2003); men billige kulstofkilder, såsom sirup og melasse, er tidligere blevet anvendt til mikrobiel levanproduktion (Özcan og Öner, 2015). Kucukukasik et al. (2011) undersøgte sukkerroemelasse og stivelsesmelasse som saccharoseerstatning i Halomonas-kulturer. Klargøring, pH, svovlsyre, tricalciumphosphat og aktivt kulforbehandlinger blev anvendt i forskellige kombinationer for at justere den kemiske tilgængelighed for levanproduktion. Det blev konkluderet, at det maksimale levanudbytte blev opnået ved en TCPHAC-koncentration på 10 g/L, dvs. henholdsvis 4,19 og 3,68 g/L. Ved anvendelse af 30 g/L TCPHAC og HAC blev der opnået et levanudbytte på 7,56 og 4,44 g/L. Fjernelse af tungmetaller og forøgelse af jernkoncentrationen resulterede i et fald i celleintegritet og levanudbyttet i denne undersøgelse. I andre undersøgelser blev der anvendt blackstrap sukkerrørsmelasse i Bacillus lentus V8-kulturer (Abou-Taleb et al., 2015), dadelsirup i Mycobacterium levaniformis 1406-kulturer (Moosavi-Nasab et al, 2010), sukkerroemelasse i Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475-kulturer (Han og Watson, 1992), og sukkerrørsmelasse og sirup i Z. mobilis ATCC 31821-kulturer (De Oliveira et al, 2007) blev undersøgt som billige kulstofkilder til levanproduktion.

Levan biosyntese i submerged fermenteringssystemer er begrænset af kravet om cellevækst, der måske ikke opfylder de optimale betingelser for høj levansucraseaktivitet (Santos-Moriano et al., 2015). Cellefrie systemer fjerner imidlertid denne begrænsning og giver yderligere fordele, såsom nem forberedelse, genanvendelighed og kontrol af ændringer i mikromiljøet (Jang et al., 2001). Af denne grund er det afgørende at give levansucrase et optimalt miljø. For eksempel undersøgte Lu et al. (2014) indflydelsen af forskellige faktorer, såsom substratkoncentration, reaktionstid, temperatur og pH, på levansucraseproduktion ved hjælp af rekombinant levansucrase i et cellefrit system. De observerede et maksimalt udbytte af levan (7,1 g/L) ved brug af 0,8 M saccharose, pH 6,5 og 40 °C i 24 timer. Udbyttet af levan steg parallelt med en stigning i saccharosekoncentrationen fra 0 til 0,8 M. Deres undersøgelse viste, at det rekombinante enzym udviser lignende biokemiske egenskaber som det native enzym.