Biologiske analyser af Bradykininin og beslægtede kininer
Kininer er potente hypotensive stoffer i alle undersøgte dyrearter (54). Den mest almindelige in vivo-test for disse peptider er rotteblodtrykket, der er beskrevet tidligere. Vasodilaterende virkninger af kininer måles i isolerede perfunderede organer med intakt endothelium i overensstemmelse med den procedure, der er beskrevet i afsnit IV. Den afslappende virkning af kininerne i arterielle kar vurderes in vitro i hundens halspulsårer (57) efter den metode, der er beskrevet af Regoli og Barabé (34). Den venokonstriktoriske virkning måles in vitro i kaninens halsvener (42) efter den nedenfor sammenfattede fremgangsmåde.
Venerne, der er udtaget fra kaniner (1,0-2,0 kg), skæres i 2 mm brede og 2 cm lange spiralformede strimler og suspenderes i Krebs-opløsning (iltet ved 37°C) indeholdende en konverteringsenzym-hæmmer (Captopril, 10 μM) for at forhindre nedbrydning af kinin (34). Vævets sammentrækninger som reaktion på kininer registreres som beskrevet ovenfor, og der måles normalt fuldstændige koncentrations-respons-kurver for at vurdere affiniteterne af kininer og deres antagonister. Kaninens halsvener har vist sig at indeholde en B2-receptorsubtype (B2A) (tabel V).
Det mest almindeligt anvendte ikke-vaskulære præparat er marsvinsileum, som tages fra marsvin på 250-350 g og præpareres som en langsgående glat muskelstrimmel i henhold til Rang (37). Vævet suspenderes in vitro i Krebs-opløsning (iltet ved 37°C), og dets spændingsændringer måles som beskrevet ovenfor for de isolerede kar (se afsnit I). Meegrise-ileum er det præparat, der anvendes til karakterisering af B2B-receptorsubtypen (tabel V).
B1-receptorer undersøges ved hjælp af kaninaortastrimlen, der er fremstillet og håndteret på samme måde som for angiotensin. Vævet er næsten ufølsomt over for kininer, især over for desArg9BK, Bt-receptoragonisten, i begyndelsen af forsøget. Vævets følsomhed øges i løbet af flere timers inkubation (op til 6-10 timer), efterhånden som B1-receptorer dannes de novo (55). De kontraktile virkninger af kininerne registreres og analyseres ved hjælp af de samme instrumenter og fremgangsmåder, som er beskrevet i afsnit I for angiotensin. Kaninvæv kan sensibiliseres for desArg9BK ved at forbehandle dyrene med lipopolysaccharid (LPS), som injiceres intravenøst 5 timer før aflivning af dyret (56). Mekanismen for B1-receptorgenerering ved LPS er blevet undersøgt (60, 61). Aortas og andre væv fra LPS-behandlede kaniner reagerer på desArg9BK fra begyndelsen af inkubationen in vitro (56). Tilsvarende udtrykker hundens nyrearterier B1-receptorer spontant og viser høj følsomhed over for desArg9BK (62).
Der er blevet anvendt flere forbindelser til at karakterisere kininreceptorer i isolerede organer ved hjælp af de biologiske reaktioner (kontraktile) af tre præparater (tabel V). Bradykininer og kallidin er potente stimulatorer af kaninens halsvener (RJV) og marsvinsileum (GPI), hvorimod desArg9BK og Lys,desArg9BK er inaktive. Den modsatte rækkefølge af potens observeres i kaninaorta (RA). desArg9BK er kun en antagonist på RA. På dette grundlag foreslog Regoli og Barabé (54) hypotesen om to kininreceptorer, B1 (RA) og B2 (RJV, GPI og mange andre præparater og forsøg), som i første omgang kun blev karakteriseret med agonister (54) og efterfølgende (se nedenfor) er blevet karakteriseret med antagonister. B2-receptorantagonister blev identificeret af Vavrek og Stewart (63) og efterfølgende forbedret af forskellige forskere (64-66) ved at erstatte Pro3 med hydroxyprolin (Hyp), ved at tilføje et d-Arg til N-terminus, ved at erstatte Phe8 med Leu og ved at erstatte dipeptidet Pro7-Phe8 med d-Tic-Oic (67-69). En prototype af hver antagonistserie er rapporteret i tabel V for at vise, at b-2-thienyl-elanin (Thi) ikke er nødvendigt i positionerne 5 og 9, mens Hyp3 og d-Arg0 er vigtige for affiniteten, især på RJV. Substitutionen af Phe8 med Leu fører sammen med de andre modifikationer til d-ArgBK, som (a) er næsten uden agonistisk aktivitet, og (b) er aktiv på RJV, mindre aktiv på GPI og ret dårlig på RA (B1), og derfor er ret selektiv for B2-stedet. Forskellen mellem pA2-værdierne (med to log-enheder) mellem RJV og GPI er et afgørende resultat for den foreslåede (tabel V) underopdeling af B2-receptorer i B2A (RJV) og B2B (GPI). D-ArgBK er en kompetitiv antagonist, der er hurtigt reversibel både in vivo og in vitro og adskiller sig fra Hoe 140, som er ikke-kompetitiv (ikke-ligevægt), sandsynligvis fordi den har en langvarig interaktion med både B2A- og B2B-stederne (59, 67, 68, 70). Sondringen mellem B2A og B2B understøttes af de resultater, der er opnået med de to sidste forbindelser (tabel V), som adskiller sig ved resterne i den tredje position. Tilstedeværelsen af Hyp begunstiger antagonisme (pA2 7,6) på B2A og delvis agonistisk aktivitet på B2B, mens Tyr3 giver en potent agonist på B2A og en ret god antagonist (ren antagonist) på B2B. Denne nye klassifikation er blevet præsenteret i en oversigtsartikel (71). De funktionelle steder for kinin er derfor B og B2 (to subtyper er overvejet). Flere andre receptorer (B3, B4 og B5) er blevet foreslået (72-74), men deres eksistens er ikke blevet påvist med solide eksperimentelle data (se den kritiske gennemgang i Ref. 59). Den kinin-inducerede histaminfrigivelse fra rotteperitoneale mastocytter er et uspecifikt fænomen, som er blevet tilskrevet kininernes kationiske karakter (75, 76).