To af de uløste, men vigtige spørgsmål inden for epigenetik er, om der findes arginin-demethylaser (RDM’er), og om proteolytisk spaltning af histonhaler og efterfølgende histonremodellering er en vigtig epigenetisk modifikationsproces. Jumonji-domæne (JmjC)-holdige proteiner er blevet karakteriseret som lysin-demethylaser (KDM’er) i en vis grad (Klose et al., 2006). Nye beviser tyder på, at de også katalyserer demethyleringsreaktion på argininresterne og proteolytisk fjernelse af histonhaler. Disse processer er sandsynligvis forbundet med biologiske betydninger. Dette forskningshøjdepunkt har til formål at give et fugleperspektiv af den aktuelle status for de udvidede biokemiske egenskaber af JmjC-holdige proteiner som RDM’er og methyleringsafhængige histonhaleklipningsenzymer.
De JmjC-holdige proteiner er en familie af ikke-haem jern(II)- og 2-oxoglutarat (2OG eller α-ketoglutarat)-afhængige oxygenaser med en karakteristisk dobbeltstrenget og antiparallel β-arkstruktur. Et eksempel på JMJD5 (PDB 4gjy) er vist i figur 1A. Vores omfattende tredimensionelle (3D) strukturelle tilpasning af tilgængelige krystalstrukturer af 23 JmjC-holdige proteiner viser, at tidligere identificerede asparat/glutamat- og to histonrester koordinerer jern(II)-kofaktoren, mens to aromatiske ringholdige rester (W, Y eller F) spiller en kritisk rolle i stabiliseringen af både jern(II) og den katalytiske lomme med π-kation-interaktioner (Figur 1A). Familien er blevet klassificeret i syv underfamilier på grundlag af deres sekvenser (Klose et al., 2006). Vores 3D strukturelle alignment med TM-score heatmap bekræfter en sådan clustering (Figur 1B). Et nyt familiemedlem, TYW5, som muligvis passer ind i den forældreløse underfamilie, er blevet identificeret under vores seneste søgning (Figur 1C). Indtil videre er 22 ud af 31 familiemedlemmer blevet rapporteret til at besidde en KDM-aktivitet på stederne K4, K9, K27 og K36 af histon 3 samt ikke-histonsubstrater i mono-, di- og tri-methyleringsformer (Figur 1C). Det er forudsigeligt, at demethyleringsaktiviteten hos resten af JmjC-holdige proteiner og deres aktivitet på yderligere substrater vil blive identificeret, når teknologier som specifikke antistoffer og følsom massespektrometri er til rådighed. Enzymerne udtrykkes i høj grad under den hæmatopoietiske udvikling og kan spille en vigtig rolle hos højere dyr og mennesker. På nuværende tidspunkt tilskrives langt størstedelen af de identificerede biologiske funktioner af de JmjC-holdige proteiner deres KDM-aktivitet.
Strukturlighed, biokemiske aktiviteter og katalytisk mekanisme i JmjC-domæneholdige proteinfamilier. (A) 3D-struktur, der afbilder polypeptidryggen af JmjC-domænet af JMJD5 (PDB 4gjy) og rester, der er nødvendige for jernbinding. (B) Strukturel lighedsvarmekort for JmjC-proteiner baseret på TM-score. Den maksimale TM-score bruges til at sammenligne proteinstrukturens lighed. (C) Biokemiske aktiviteter for JmjC-proteiner. +, oxygenaseaktivitet er blevet påvist. (D) Skemaer, der viser den katalytiske mekanisme for lysin/argininin-demethylering formidlet af JmjC-proteiner, herunder trinene for hydroxylering af C-H-bindingen og N-methylgruppedemethylering via C-hydroxylering, efterfulgt af fragmentering af et hemiaminalt mellemprodukt.
Strukturlighed, biokemiske aktiviteter og katalytisk mekanisme for JmjC-domæne-holdige proteinfamilier. (A) 3D-struktur, der afbilder polypeptidryggen af JmjC-domænet af JMJD5 (PDB 4gjy) og rester, der er nødvendige for jernbinding. (B) Strukturel lighedsvarmekort for JmjC-proteiner baseret på TM-score. Den maksimale TM-score bruges til at sammenligne proteinstrukturens lighed. (C) Biokemiske aktiviteter for JmjC-proteiner. +, oxygenaseaktivitet er blevet påvist. (D) Skemaer, der viser den katalytiske mekanisme for lysin/argininin-demethylering medieret af JmjC-proteiner, herunder trinene for hydroxylering af C-H-bindingen og N-methylgruppe-demethylering, via C-hydroxylering, efterfulgt af fragmentering af et hemiaminalt mellemprodukt.
Mens arginininmethyltransferaser er blevet identificeret, og deres funktion i celler er blevet veldokumenteret (Yang og Bedford, 2013; Fuhrmann et al, 2015), er RDM’er endnu ikke blevet identificeret. Jmjc domain-containing 6 (JMJD6) blev tidligere rapporteret som en formodet RDM for asymmetrisk dimethylarginin (ADMA) og symmetrisk dimethylargininin (SDMA) histonsubstrater H3 og H4 (Chang et al., 2007). Denne funktion blev imidlertid udsat for modstridende rapporter. To opfølgende rapporter viste, at JMJD6 kun katalyserer 2OG-afhængig C-5 hydroxylering af lysinrester i mRNA-splejsning-regulerende proteiner og histoner (Webby et al., 2009; Mantri et al., 2010). For nylig viste en undersøgelse, at visse KDM’er besidder RDM-aktivitet på methylerede histonpeptidmodelsubstrater (Walport et al., 2016) (Figur 1C). Den katalytiske mekanisme for JmjC-proteiner er katalysering af hydroxylering af C-H-bindinger og N-demethylering via hydroxylering (Figur 1D). Det aktive sted Fe(II) er bundet af HXD/E…H og kofaktor 2OG. I mangel af substrater katalyserer 2OG-afhængige oxygenaser ofte en langsom, afkoblet reaktion, hvor 2OG dekarboxyleres til succinat, kuldioxid og et reaktivt Fe(IV)=O-ferrylintermediat. Tilsætning af substrater i reaktionen vil stimulere processen dramatisk. Dette jern(IV)-oxo-intermediat oxiderer derefter C-H-bindingen og fører til dannelse af et hydroxyleret produkt. Hvis hydroxyleringen sker på en methylgruppe på et amidogen, vil denne proces danne et ustabilt hemiaminal. Hydroxymethylen frigives sandsynligvis spontant som formaldehyd, hvilket resulterer i et demethyleret substrat. Processen skelner ikke mellem methylarginin og methylysin. Hydroxylering er et mellemliggende trin i demethyleringen.
Det er for nylig blevet rapporteret, at to forældreløse JmjC-holdige proteiner, JMJD5 og JMJD7, har tosidige kationafhængige proteaseaktiviteter, der fortrinsvis kløver halerne af histon 3 eller 4 indeholdende methyleret lysin eller argininin (Figur 1C). Efter den indledende specifikke spaltning fordøjer JMJD5 og JMJD7, der fungerer som aminopeptidaser, gradvist de C-terminale produkter, hvilket er en methyleringsafhængig peptidaseaktivitet og også betegnes som clipping (Liu et al., 2017; Shen et al., 2017). Blandt 23 JmjC-domæneholdige proteiner med krystalstrukturer indeholder de fleste af dem Zn2+ ud over Fe2+, hvilket øger muligheden for, at JmjC-holdige proteiner kan fungere som methylgruppeafhængige metalloproteaser. De forældreløse medlemmer af underfamilien, såsom JMJD5, har kun to rester til at koordinere Zn2+, som kunne være fleksible til peptidasereaktion i lighed med dem i metalloproteaser. I modsætning hertil har medlemmerne i PHF2/PHF8- og JMJD2/JHDM3-underfamilierne fire rester til koordinering af Zn2+, som er stive, begravet og ikke tilgængelige for substratet. For JARID- og UTX/UTY-underfamilierne er Zn2+ langt væk fra Fe(II)-katalysecentret, hvilket gør det vanskeligt for en koordineret reaktion mellem methylgruppegenkendelse og klipning. Der er behov for yderligere eksperimenter for at teste, om Zn2+ -status i proteinerne er en afgørende faktor for en sådan kløvning. Den biologiske betydning af en sådan reaktion er endnu ikke klarlagt, men den kunne være involveret i transkriptionel regulering, DNA-skadesrespons og apoptose med henblik på hurtigt at udtømme histonerne og remodellere kromatinstrukturen for at udsætte DNA for de nødvendige reaktioner.
,
,
,
,
,
, et al. . (
).
.
,
–
.
,
,
,
, og
,
(
).
.
,
–
.
,
,
,
, og
,
(
).
.
,
–
.
,
,
,
,
,
, et al. . (
).
.
,
–
.
,
,
,
,
,
, et al. . (
).
.
,
–
.
,
,
,
,
,
, et al. . (
).
.
,
–
.
,
,
,
,
,
, et al. . (
).
.
,
.
,
,
,
,
,
, et al. . (
).
.
,
–
.
,
, og
,
(
).
.
,
–
.