Kharles 5. måtte finde et andet portræt fra Østrig, det portræt, som Isabella af Portugal sendte til Margret, før hun døde. Hans søster sendte portrættet i november Charles var meget skuffet over, at det ikke lignede et portræt til hans kone. Da han var utilfreds med portrættet, måtte han bede Titian om at finde en kunst, der lignede hans kone.
Titian malede Isabella-portrættet i 1545, Titian møblerede det, og Karls kone havde sort kjole og i sit skød havde hun blomster bag sig, hun havde en storslået krone. I EI Pardo paladset blev denne kunst ødelagt ved hjælp af en brand denne historie er i prints og flere kopier. Portrættet havde mistet næsen, så Karl tog det med til Augsburg, så kunstneren kunne arbejde på det for at male næsen igen. I september 1548 brugte kunstneren den gamle model til at lave den nuværende model, og den blev også malet i Augsburg. Karl og Isabella havde et portræt sammen og et duplikat i Fundacion Casa de Alba Collection i Madrid dette var den bedste og første kombination af Isabella af Portugal og Karl V.
Titians kunst bragte minder om Isabella af Portugal og den, der havde dem begge, mindede Karl om sin hustru. Karl bad om kunst, og han ønskede ikke nøjagtige malerier, men ønskede at visualisere dem, han havde i tankerne. Karl ønskede, at Tizian skulle male portrættet af den forsvundne næse, fordi han kunne male det på den måde, som næsen så ud. De portrætter, der blev lavet i hendes levetid, så ægte ud, og de viste, at Isabella af Portugal havde en akilinær næse, hvilket var et unikt træk, som mange bemærkede. Titian måtte foretage samme korrektion fra en klassisk lige næse til en buet næse, som Isabella af Portugal havde. De små ting i portrætterne, der bragte minder om Isabella, fik Karl til at holde kunsten tæt, og alt dette er bevaret i dokumenter som Yuste og Bruxelles, hvor sidstnævnte blev dokumenteret i 1556 og førstnævnte i 1558.
De portrætter, som Tizian lavede, lå tæt op ad Giulio Romanos portrætter. Den af Eleonora Gonzaga en Urbino hertuginde er hvad Titian kiggede og brugte de færdigheder i malerierne til at lave Isabella portrætter. Isabella af Portugal-billederne var på en eller anden måde udfordrende, da det ikke var en realitet, men blot et for at bringe minderne tilbage. Isabella af Portugal portrætter var stort arbejde udført af Titian, men hvis man kiggede nærmere efter, viste det dog, at det anvendte lærred tidligere var en kunst af en kvinde. Det malede lærred Isabella af Portugal blev givet til Maria, søster til Filip den Anden. Det var til et kloster kaldet Descalzas Reales. I 1636 blev det taget i Madrid på Alcazar det forblev der i samme år, indtil da der var en brand i 1734.