Abstract

Cellulært stofskifte afhænger af en passende koncentration af intracellulært uorganisk fosfat (Pi). Pi-sult-responsive gener synes at være involveret i flere metaboliske veje, hvilket antyder et komplekst Pi-reguleringssystem i mikroorganismer og planter. En gruppe enzymer er nødvendige for at optage og opretholde et passende fosfatniveau, som frigøres fra fosfatestere og -anhydrider. Fosfatasesystemet er særlig velegnet til undersøgelse af reguleringsmekanismer, fordi fosfataseaktivitet let kan måles ved hjælp af specifikke metoder, og forskellen mellem det undertrykte og det derepressede niveau af fosfataseaktivitet let kan påvises. I denne artikel analyseres det proteinphosphatasesystem, der induceres under fosfat-sult i forskellige organismer.

1. Indledning

Regulering af cellulære processer, såsom cellulær differentiering, proliferation, celledød, mobilitet, metabolisme, overlevelse og organisering af cytoskelettet, som reaktion på nogle stimuli er grundlæggende for alle aspekter af cellelivet . Proteinfosforylering er en af de mest almindelige mekanismer, der anvendes til at regulere disse processer. Processer, der styres reversibelt ved hjælp af proteinfosforylering, kræver både en proteinkinase og en proteinfosfatase .

Traditionelt er proteinkinaser blevet studeret mere intensivt end proteinfosfataser på grund af den tidligere opfattelse, at proteinkinaser giver finregulering af proteinfosforylering, mens proteinfosfataser blot virker til at fjerne fosfatgrupper. Først i det sidste årti er man blevet klar over, at proteinfosfataser også reguleres af en række forskellige mekanismer og ikke er mindre vigtige for den cellulære fysiologi end proteinkinaser . Proteinphosphataser er i stand til at hydrolyse phosphomonoestermetabolitter og frigøre uorganisk fosfat (Pi) fra disse substrater .

Phosphor, i form af uorganisk fosfat (Pi), er et af de vigtigste makronæringsstoffer for alle organismer . Det bruges ikke kun i biosyntesen af cellulære komponenter, såsom ATP, nukleinsyrer, fosfolipider og proteiner, men det er også involveret i mange metaboliske veje, herunder energioverførsel, proteinaktivering og metaboliske processer for kulstof og aminosyrer . Der er behov for store mængder fosfat for at sikre cellens overlevelse. I planter er Pi afgørende for vækst og udvikling . I svampe regulerer Pi-signaltransduktionsvejen ekspressionen af mange fosfatresponsive gener, som er involveret i opfangning og Pi-optagelse fra ekstracellulære kilder . Hos trypanosomatiske parasitter påvirker Pi deres evne til at vokse korrekt og kolonisere i den hvirvelløse vært .

Sammenfattende er proteinfosfataser og -kinaser nødvendige for Pi-homeostase i forbindelse med erhvervelse, lagring, frigivelse og metabolisk integration af Pi . Formålet med denne artikel er at opsummere reguleringen af fosfataser ved uorganisk fosfat med vægt på disse enzymers rolle i cellebiologien.

2. Feedback kontrol af fosfataser ved uorganisk fosfat: PHO-vejen

Saccharomyces cerevisiae har flere fosfataser med forskellige specificiteter, cellulær placering og permeaser, der anvendes i Pi-optagelse. Sættet af gener, der er ansvarlige for disse aktiviteter, er koordineret undertrykt af Pi-koncentrationen i vækstmediet . Cellens optagelse, lagring, frigivelse og metaboliske integration af Pi kræver deltagelse af mange vigtige enzymer som f.eks. ekstracellulære syrephosphataser (APaser), phosphodiesteraser, Pi-transportører, polyphosphatkinaser, alkaliske phosphataser (ALPaser) og endopolyphosphataser . Aktiviteterne af disse enzymer er uløseligt forbundet med Pi-homeostase, og de er underlagt regulering via Pi-signaltransduktionsvejen (PHO) som reaktion på varierende Pi-niveauer .

I en nuværende model for PHO-regulering er den positive regulator (eller positive faktor) Pho4p, der er kodet af PH04-genet, uundværlig for transkriptionel aktivering af PHO-generne ved sin aktivitet og placering. I et højt Pi-medium hæmmer et cyclinafhængigt kinase (CDK)-kompleks bestående af Pho80p og Pho85p Pho4p-funktionen ved hyperfosforylering. Hyperfosforyleret Pho4p forbliver i cytoplasmaet og er ikke i stand til at aktivere transkriptionen af PHO-generne . Når Pi-koncentrationen i mediet er tilstrækkelig lav, hæmmer Pho81p funktionen af Pho80p-Pho85p-komplekset , hvilket gør det muligt for Pho4p at flytte til kernen og aktivere transkriptionen af PHO-generne . Disse gener koder for de højaffinitetstransportører Pho84p og Pho89p; de sekreterede syrephosphataser Pho5p, Pho11p og Pho12p; andre beslægtede proteiner, der øger Pi-genoprettelsen fra ekstracellulære kilder .

Denne PHO-vej er blevet beskrevet i forskellige organismer såsom planter , bakterier og svampe .

3. Fosfatasesystemet i gær

I første omgang blev det observeret, at flere fosfatase gener moduleres af Pi koncentrationen i kulturmediet; således blev PHO vejen oprindeligt karakteriseret ved differentielt udtrykte fosfataser .

I S. cerevisiae er transkriptionen af gener, der koder for sure og alkaliske fosfataser og Pi transportøren, koordineret undertrykt og derepresset afhængig af Pi koncentrationen i kulturmediet . De fleste af de fosfataser, der syntetiseres under Pi begrænsende forhold, er ekstracellulært placeret eller er associeret med plasmamembranen eller cellevæggen.

De Pi-regulerede fosfatasegener omfatter PHO5 , som koder for hovedparten af de undertrykkelige sure fosfataser (rAPase; optimum pH 3-4; EC 3.1.3.2), og dets isozymer PHO10 og PHO11 . Disse tre rAPaser er glykoproteiner, der findes i cellevæggen eller i det periplasmiske rum. De er ansvarlige for fosfatopfangning og arbejder sammen med transportører med høj affinitet for at opsamle fosfat, når Pi-koncentrationen i miljøet er lav . Den rAPase, der er kodet af PHO5-genet, er glykosyleret under sekretion gennem membranen og er lokaliseret i det periplasmatiske rum . Pho5p er ansvarlig for >90% af APase-aktiviteten .

Da PHO5-genproduktet udgør hovedparten af de sure fosfataser, er PHO5-reguleringen afgørende for den cellulære fosfathomøostase . Transkriptionelle aktivatorer, Pho4p og Pho2p, er nødvendige for at generere den aktive kromatinstruktur i PHO5-promotoren og stimulere transkriptionen. Pho80p-Pho85p er et cyclin/cyclinafhængigt kinase-kompleks, der fosforylerer Pho4p på flere steder for at regulere Pho4p-funktionen negativt . Huang og O’Shea gennemførte en kvantitativ, enzymatisk screening med højt gennemløb af en samling af gærdeletioner for at finde nye mutanter, der er defekte i PHO5-ekspression. Blandt de konstitutive mutanter viste pho80- og pho85-stammerne de mest forhøjede niveauer af Pho5-fosfataseaktivitet og PHO5-mRNA under højfosfatforhold, hvilket er i overensstemmelse med deres centrale rolle i PHO-vejen. Fuldstændigt tab af den høje kinaseaktivitet (Pho80p-Pho85) resulterer i fuld aktivering af Pho4-transskriptionsfaktoren, hvilket fører til fuld PHO5-ekspression.

En anden vigtig klasse af fosfataser i S. cerevisiae er de alkaliske fosfataser (ALPase; optimum pH 8; EC 3.1.3.3.1). PHO8 koder for en uspecifik repressibel alkalisk fosfatase (rALPase). Det er et vacuole-lokaliseret glykoprotein, der kløver forskellige substrater for at hente fosfat fra intracellulære produkter . Pho8p er et Mg2+/Zn2+-afhængigt dimerisk protein, der ligner ALPase i Escherichia coli og i pattedyrceller . PHO13’s enzymprodukt er et monomerisk protein og er specifikt for p-nitrophenylphosphat (pNPP) og histidinylphosphat. Dette enzym blev stærkt aktiveret af Mg2+-ioner, med et pH-optimum på 8,2 og en høj specifik aktivitet for pNPP med en middelværdi på 3,6 × 10-5 M .

4. Phosphorus Stress Modulates Acid Phosphatases in Plants

Syre fosfataser (APaser) kan være aktive mod en bred vifte af organiske fosfater, der findes i jorden. Disse enzymer er uspecifikke orthofosforiske monoesterphosphohydrolaser (EC 3.1.3.2), der spalter Pi fra esterbindingssteder. Sekreterede plantephosphataser opretholder 50 % aktivitet over et bredt pH-område (4,0-7,6), opretholder 80 % aktivitet over et bredt temperaturområde (22 °C-48 °C) og er stabile ved temperaturer så høje som 60 °C, hvilket gør dem til ideelle kandidater for aktive jordbundsenzymer .

APaser er hyppigt forekommende i Arabidopsis og er repræsenteret af mindst fire genfamilier. En nylig undersøgelse af det annoterede Arabidopsis-genom identificerede sekvenser for 1 His APase, 4 fosfatidiske APaser, 10 vegetative opbevaringsprotein-APaser og 29 purple APaser .

I de seneste år har der været betydelig interesse for purple APaser (PAP’er). Komparativ analyse af strukturen af PAP’er fra højere planter og pattedyr har gjort det muligt at identificere konserverede sekvens- og strukturmotiver i denne type enzym fra mange eukaryote arter .

Biokemisk set fungerer plante-PAP’er som homodimere proteiner med en molekylmasse på ~55 kDa pr. monomer, mens PAP’er fra pattedyr typisk er monomere proteiner med en molekylmasse på ~35 kDa . Mange PAP’er er glykoproteiner, der er målrettet mod sekretoriske veje . En PAP fra Spirodela oligorrhiza har vist sig at være glycosylphosphatidylinositolforankret i cellen . Strukturelt set har plante-PAP’er to domæner. NH2-domænet har ingen katalytisk funktion. COOH-domænet har metalcentret og er enzymets katalytiske domæne. En anden PAP fra Lupinus albus kan indeholde et tredje domæne med en struktur, der ligner steroldesaturasernes, ved sin carboxylterminus . Det vides ikke, hvor almindelige de to sidstnævnte former for posttranslationel modifikation er i PAP’er fra andre arter. PAP’er er metalloenzymer, der har et binukleært metalionkompleks i deres aktive sted. Deres karakteristiske lyserøde til lilla farve skyldes en ladningsovergang ved en tyrosinrest, der koordinerer en jern-ion . Dette enzym kan hydrolyserer fosforsyreestere og -anhydrider .

PAP’er er blevet isoleret fra Phaseolus vulgaris (almindelig bønne) , Glycine max (sojabønne) , Lupinus albus (hvid lupin) , Lycopersicon esculentum (tomat) , Triticum aestivum (hvede) , Hordeum vulgare (byg) , Zea maize (majs) og Oryza sativa (ris) .

Planternes reaktion på Pi-sult kan inddeles i to kategorier: den specifikke reaktion og den generelle reaktion. De specifikke reaktioner fremmer effektiv mobilisering og erhvervelse af Pi fra vækstmediet og intracellulære lagre. De generelle reaktioner giver mulighed for langsigtet overlevelse ved at koordinere cellestofskiftet med næringsstoftilgængelighed og vækstpotentiale . Gennemførelsen af disse strategier kræver ændringer i ekspressionsprofilerne for hundredvis af gener, som det fremgår af transkriptomanalyser af Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) .

Under Pi-sult øger planter fosfataseekspressionen som et generelt svar . Phosphataseproduktion er forbundet med Pi-mangel, og der er foreslået en positiv korrelation mellem syrephosphataseproduktion og Pi-næring . F.eks. producerer planter som lupiner, der er mere effektive til at optage Pi fra jorden, betydeligt mere fosfatase i forhold til korn .

Wu et al. analyserede reguleringen af proteinphosphataser i Arabidopsis og fandt, at tre gener for PAP blev induceret af Pi-sult . Desuden blev genet At1g25230 induceret mere end 2-foldigt, hvilket viser, at dette gen reagerer på Pi-sult.

I risgenomet blev i alt 26 putative PAP-gener identificeret, og Pi-sult inducerede ekspressionen af 10 ris-PAP-gener, hvilket tyder på, at disse spiller vigtige roller i risens akklimatisering til lave Pi-forhold .

I Lycopersicon esculentum (tomat), LePS2, induceres af Pi-sult . Det bemærkes, at LePS2-fosfataser repræsenterer de første cytoplasmatiske fosfataser, der er komponenter i Pi-sultreaktionen . Suspendering af tomatceller i Pi-sultmedium førte til en PAP-specifik aktivitetsstigning på ca. 4 gange, men den PAP-specifikke aktivitet forblev lav og konstant i celler, der blev opretholdt i et medium med højt Piindhold. Stigningen i PAP-aktiviteten i celler, der vokser i Pi-sultmedium, viser, at PAP kan spille en rolle ved at øge tilgængeligheden og udnyttelsen af Pi og kan være afgørende for mobiliseringen af intracellulær Pi ved at registrere mangel på Pi i tomat .

5. Ektofosfataser som Pi-sensorer

Cellernes plasmamembran kan indeholde enzymer, hvis aktive steder vender ud mod det eksterne medium i stedet for mod cytoplasmaet. Aktiviteterne af disse enzymer, der betegnes ektoenzymer, kan måles ved hjælp af intakte celler . Ektofosfataser og ektokinaser er blevet påvist i flere mikroorganismer, herunder protozoer , bakterier og svampe .

Flere undersøgelser har påvist en rolle for ektofosfataser i erhvervelse af Pi til brug i væksten af forskellige celletyper . I svampeceller (Fonsecae pedrosoi) inducerer udtømning af Pi fra kulturmediet tilsyneladende ekspression af forskellige ektofosfataseaktiviteter . Dyrkning af disse svampe i fravær af eksogent Pi har vist sig at resultere i dannelse af svampeceller, der udtrykker en ektofosfataseaktivitet, der er 130 gange højere end den, der udtrykkes af svampe, der er dyrket i tilstedeværelse af Pi . Trypanosomatiske celler har ektofosfataser, der tilfører Pi ved at hydrolyserer phosphomonoestermetabolitter . For eksempel inducerer en lav Pi-koncentration i vækstmediet hos T. rangeli ekspression af en anden ektofosfataseaktivitet , hvilket tyder på, at dette enzym fører til hydrolyse af fosforylerede forbindelser, der findes i det ekstracellulære medium. Denne hydrolyse kan bidrage til tilegnelsen af Pi under udviklingen af T. rangeli epimastigoter .

Under betingelser med Pi-begrænsning udtrykker fluorescerende bakterier Pseudomona et sæt fosfathungergener . For eksempel induceres mindst 56 Pi-sultningsproteiner i P. putida-stammen KT2442 , og i P. fluorescens-stammen DF57 er der rapporteret om induktion af flere fosfat-sultningsgener .

I mange eukaryoter er nucleotidpyrofosfatase/phosphodiesterase (E-NPP)-familien af proteiner direkte ansvarlig for fosfathydrolyse fra ekstracellulære nukleotider. NPP1 til -3 findes i næsten alle humane vævstyper, og disse enzymer indeholder et alkalisk ektonukleotidpyrofosfatase/phosphodiesterase type 1-domæne. I S. cerevisiae opreguleres NPP1 og NPP2 via Pi-reguleret transkription.

6. Afsluttende bemærkninger

Pi er et stof, der er vækstbegrænsende i forskellige organismer, når dets tilgængelighed er lav i mange økosystemer . Induktion af fosfataseaktivitet som reaktion på Pi-sult er et almindeligt fænomen blandt organismer, der får Pi fra omgivelserne. Disse enzymer er i stand til at hydrolyse fosforylerede substrater for at tilvejebringe en kilde til Pi under en mangel på næringsstoffer. I Saccharomyces cerevisiae udløser Pi-sult-signalet en øget produktion af mindst fire typer fosfataser: (1) de sure fosfataser Pho5, Pho11 og Pho12, som er lokaliseret i det periplasmatiske rum; (2) den alkaliske fosfatase Pho8, som er lokaliseret i vacuolen; (3) glycerolfosfatasen Hor2; (4) den formodede polyfosfatase Phm5, som er lokaliseret i vacuolen. Alle disse enzymer kan bidrage til øgede niveauer af frit Pi . Andre funktioner kan imidlertid tilskrives disse enzymer.

Del Pozo et al. oprensede en sur fosfatase, AtACP5, som induceres af Pi-sult i Arabidopsis thaliana. Dette enzym præsenterer to aktiviteter, hydrolyse af fosforylerede substrater og peroxiddannelse. Phosphataseaktiviteten afspejler sandsynligvis en rolle i Pi-mobilisering; peroxidationsaktiviteten antyder, at AtACP5 også kunne spille en rolle i metabolismen af reaktive oxygenarter .

Totalt set spiller Pi-sult-inducerede fosfataser en rolle i en organismes tilpasning til stress, selv om der kan findes andre roller.

Anerkendelser

Forfatterne anerkender den finansielle støtte fra Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), og Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). C. F. Dick og A. L. A. Dos-Santos har bidraget ligeligt til dette arbejde.