Makrofager i metastasedannelse

Makrofager har vist sig at fremme ekstravasation af CTC’er og dannelse af mikrometastaser i væv hos mus39,48. I tumormetastaser kan der findes en population af metastaseassocierede makrofager (MAM’er). I en undersøgelse, der anvendte en FVB-musemodel af lungemetastaserende PyMT-brystkræft49 , blev det vist, at disse celler rekrutteres fra cirkulerende inflammatoriske monocytter af CCL2-sekretorerende tumorceller48. Det er bemærkelsesværdigt, at det ved adoptive overførselsundersøgelser blev vist, at denne monocytpopulation foretrækker metastasestedet frem for det primære tumorsted48. Desuden viste en genekspressionsundersøgelse af invasive TAM’er isoleret in vivo fra PyMT-musemodellen, at denne unikke, fænotypisk forskellige makrofagpopulation er beriget med gener relateret til embryonal- og vævsudvikling, hvilket tyder på, at TAM’er måske rekapitulerer nogle udviklingstrofefunktioner for at fremme tumorprogression. En af de veje, der blev stærkt beriget og valideret, var Wnt-signalvejen, især Wnt7b, som vides at være opreguleret i humane brysttumorer, der er forbundet med fremskreden sygdom50.

Konditioneret medium fra in vitro differentierede og M1 polariserede humane makrofager viste sig at nedregulere østrogenreceptor alfa-ekspression i MCF-7 brystkræftcellelinjen via aktivering af mitogen aktiveret proteinkinase (MAPK), c-terminal Src kinase (c-Src) og proteinkinase C (PKC). Denne nedreguleringsproces har vist sig at fremme brystkræftcellers endokrine resistens, hvilket er et meget vigtigt træk ved 30 % af de metastaserende tumorer21. I en anden musemodel med brystkræft viste TAM’er ringe tumoricidal aktivitet, sandsynligvis på grund af nedsat ekspression af inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS) og nedsat produktion af nitrogenoxid (NO)51. En undersøgelse med 4T1 metastatisk brystkræft i Balb/c-mus etableret i CD1-deficiente mus (mus, der mangler naturlige dræber-T-celler, NKT, som producerer IL-13) viste, at efter fjernelse af primærtumorer overlevede musene ubegrænset i modsætning til Balb/c-mus af vildtype. Denne overlevelsesfordel, på trods af lige stor metastatisk sygdom på operationstidspunktet, skyldtes tre immunovervågningsmekanismer: dannelse af M1-makrofager, der udtrykker iNOS, som er tumortræbende for 4T1-tumorceller, hurtig reduktion af MDSC’er, der undertrykker T-celler ved at producere arginase, og produktion af aktiverede lymfocytter. CD1-deficiente mus mangler NKT-celler, der producerer IL-13, et cytokin, der er vigtigt for polarisering af M2-makrofager. Hos disse mus blev der opnået effektiv immunovervågning mod etableret metastatisk sygdom gennem tumoricidale M1-makrofager og -lymfocytter og et reduceret antal MDSC-celler efter fjernelse af den primære brysttumor2. En anden undersøgelse med den ortotopiske 4T1-model i immunkompetente Balb/c-mus afslørede, at samtidig injektion af 4T1-celler og M2-makrofager fra knoglemarven i brystfedtpuder fører til øget vækst af solide tumorer og lungemetastase. M2-makrofager øgede kræftcelleproliferation, angiogenese lymphangiogenese og infiltration af blodmonocytter52. TAM’ernes angiogenetiske potentiale i brysttumorer blev yderligere bekræftet i CSF-1-null- og CSF-1-overudtrykkende PyMT-musmodeller53.

Lige residente makrofager i fysiologisk brystudvikling understøtter bryststamcelle-nichen54 , kan TAM’er også fremme brystkræftstamcellefænotyper i murine brystkræftceller og dermed bidrage til mere invasive tumorer55-57. Af relevans for human brystkræft kan også være TAM’ernes in vitro observerede evne til at differentiere sig til osteoklastlignende celler under forhold, der efterligner knoglemikromiljøet (f.eks. tilstedeværelse af M-CSF, knogleafledte stromale celler og 1,25-dihydroxyvitamin D3)58. Indtil videre er det dog ikke klart, om dette virkelig sker in vivo. Det er heller ikke klart, om de residente knoglemarvsmakrofager eller de cirkulerende knogleinvaderende monocytter eller begge er udsat for disse fænotypeændringer ved indvirken af brystkræftceller.

CCL2, der også betegnes som monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), produceres af makrofager, fibroblaster, endotelceller og kræftceller. Overekspressions- og neutraliserende antistofundersøgelser både i bryst- (MDA-MB231 humane celler i nøgenmus)59,60 og prostataceller (PC3 humane celler i SCID-mus)61 kræftmodeller har vist, at CCL2, der stammer fra kræftceller, ved at øge rekrutteringen af makrofager fremmer kræftmetastase i knogler ved at øge rekrutteringen af makrofager. Endvidere fremmer makrofager, ved at rekruttere og aktivere osteoklaster og dermed give næring til den “onde cirkel”, antallet og væksten af knoglemetastaser af begge disse kræfttyper.

Bonemarrow derived cells, især makrofager, er kendt for at være vigtige for udvikling, vækst og vedligeholdelse af prostata. I en undersøgelse af androgenmoduleret prostataregeneration blev det f.eks. vist, at makrofager rekrutteres til den regenererende prostata ved hjælp af makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF), Regulated on Activation Normal T-cell Expressed and Secreted (RANTES) og makrofaginflammatorisk protein 1α (MIP-1α), der udtrykkes af det regenererende væv. Normale og unormale prostataepitelceller syntetiserer lokalt M-CSF, som rekrutterer og inducerer differentiering af makrofager. Det blev vist, at antallet af makrofager korrelerede med proliferationsaktiviteten af prostataproteasepitelcellerne og dermed bidrog til regenerering af prostataproteasepitelcellerne. Dette er muligvis relevant i patologiske tilstande i prostatavævet som godartet prostatahyperplasi, proliferativ inflammatorisk atrofi og prostatakræft62. Endvidere har nogle undersøgelser vist, at nogle prostatakræftcellelinjer63 og metastatisk prostatakræft viser høj ekspression af M-CSF og høj TAM-infiltration64 , mens M-CSF-manglende mus havde lavere makrofagniveauer i prostata65.

I en ortotopisk AT-1-prostatatumormodel hos rotte blev det vist, at TAM’er fremmer tumor- og karvasculær vækst, da TAM-reduktion ved CLO-LIP førte til en betydelig reduktion af tumorvækst, angiogenese og arteriogenese. Ekspression af angiogene faktorer som angiopoietin 2, CCL2, fibroblastvækstfaktor 2 (FGF-2), MMP-9, TGF-β, IL-1β viste sig at være opreguleret i AT-1-tumorer in vivo sammenlignet med AT-1-celler dyrket in vitro, hvilket tyder på, at de blev produceret af sunde celler, der er til stede i tumormassen. Ved hjælp af immunohistokemi blev MMP-9 og IL-1β fundet udtrykt kun i makrofaglignende celler, hvilket bekræfter TAM’ernes pro-angiogene aktivitet3.

I en musemodel af human prostatakræft blev det postuleret, at IL-6, en stærk kemotiltrækkende faktor for monocytter og makrofager, der udskilles af PC-3-prostatacancerceller, fremmede aggressiviteten af den dannede kræft ved at rekruttere flere TAM’er til tumorområdet. TNF-α produceret af disse TAM’er stimulerede prostatakræftcellerne til at producere yderligere IL-6, der kunne tiltrække flere makrofager, og dermed opretholde den onde cirkel, der er uundværlig for tumorvækst og metastase. I den samme musemodel førte TAM-depletion eller silencing af IL-6 i tumorceller til signifikant nedsat størrelse af knoglelæsioner, knoglelyse og forekomst af lymfeknudemetastase66. Et lignende og nyere resultat, der involverer IL-6 og prostatakræft, var undersøgelsen af Lee og kolleger67 , som viste, at overekspression af BMP-6 i humane prostatakræftceller fører til fremkomsten af kastrationsresistent prostatakræft i mus. Det blev vist, at kastrationsresistensen var medieret af IL-6, der udskilles af tumorinfiltrerende makrofager. I denne model aktiverede IL-6 PI3K-vejen, hvilket førte til en opregulering af androgenreceptorekspressionen i prostatakræftcellerne67. Med den intratibiale PC-3-cellemodel for intraossøs prostatakræftmetastasevækst i nøgenmus og catepsin K (CTSK)-mangelfulde nøgenmus er det blevet vist, at knoglelæsionens vækst er afhængig af catepsin K (CTSK). Væksten af knoglelæsioner blev reduceret betydeligt i fravær af værtsafledt CTSK. Det blev endvidere vist, at knoglemarvsresidente makrofager, ikke osteoklaster, er de vigtigste kilder til CTSK. Desuden blev det observeret, at antallet af makrofager var større i knogletumorer fra vildtype-mus og korrelerede med en accelereret tumorvækst. Det blev også påvist, at CCL2-niveauerne steg med makrofagafledte CTSK-niveauer, og at overekspression af CTSK korrelerede med en stigning i makrofag- og tumorafledte cathepsin B- og COX-2-ekspression, som begge er impliceret i osteoklastogenese og tumoraggressivitet. Tumorbærende CTSK-mangelfulde mus viste lavere niveauer af VEGF-ekspression og nedsat angiogenese. Samlet set tyder disse resultater på, at CTSK, der stammer fra makrofager og osteoklaster, bidrager til kolonisering og vækst af prostatatumorer i knogler68. En undersøgelse af prostatakræft hos mennesker viste, at kliniske prøver af prostatatumorer sjældent er TAM-fri64,69. Endvidere blev det vist, at interaktion mellem makrofager/prostatakræftceller forårsager resistens over for selektive androgenreceptormodulatorer (SARM’er). I denne interaktionsakse forårsagede makrofagafledt IL-1β afskedigelse af kernereceptor corepressorkomplekset fra androgenreceptoren og neutraliserede dermed SARM-effekterne69.

TAM’ernes rolle i osteosarkom, en primær knoglekræft, er kontroversiel eller i det mindste afhængig af tumorstadiet. I lighed med osteoklaster gør makrofager i de tidlige stadier af tumorudviklingen knoglemarven til et nærende miljø for osteosarkomceller, hvilket øger den lokaliserede tumorvækst. I de tidlige stadier af osteosarkomudviklingen synes disse celler faktisk at forhindre tumorcellemigration væk fra knoglen og dermed metastasering. Men efterhånden som tumorens volumen øges, kan kræftcelleudskillende faktorer sænke antallet og aktiviteten af osteoklaster i læsionen til under en tærskel, der er nødvendig for at opretholde den osteoklastiske niche. Som følge heraf støttes kræftcelleinvasion og metastasedannelse i stedet for yderligere vækst af den primære tumor. På samme måde kan de M1-makrofager, der er bosiddende på det sted, hvor den primære tumor er opstået, med den stigende mængde tumorudskillende faktorer blive skævvredet til M2-fænotypen, hvilket yderligere fremmer dannelsen af metastaser. Forholdet mellem M1- og M2-makrofager kan regulere osteosarkoms potentiale for metastasering ved at ændre tumormikromiljøet til et miljø, der er metastasefremmende, når et tærskelantal af begge fænotyper er nået70. En undersøgelse af humane højgradsosteosarkombiopsier før kemoterapi viste, at TAM’er i denne kræfttype er en heterogen population af både M1- og M2-makrofager. Det samlede antal makrofager var forbundet med god overlevelse, men M2-polarisering var ikke forbundet med god overlevelse. Det blev set, at 20 % af de gener, der blev overudtrykt hos patienter uden metastaser inden for 5 år efter diagnosen, var makrofag-associerede. Især CD14 og HLA-DRA (M1-markører) var uafhængigt forbundet med metastasefri overlevelse. Overlevelsesfordelen ved et højt TAM-antal kunne delvist skyldes bedre respons på kemoterapi. Kemoterapi, der dræber tumorceller, resulterer i frigivelse af endogene faresignaler, som binder sig til mønstergenkendelsesreceptorerne i TAM’er og kan skævvride deres polarisering fra M2 til M1 og dermed lette clearance af døende tumorceller og hæmme udvæksten af metastaserende tumorceller71. Desuden er der blevet foreslået en rolle for TAM’er i angiogenese og lymfangiogenese i en ny osteosarcoma-musemodel, hvor M-CSF-hæmning, ligesom i andre tumormodeller (f.eks. bryst), samtidig med at rekruttering af makrofager hæmmes, mindskede tumorvaskulariseringen og dermed mindskede tumorvækst og metastaser72.