Canine leishmaniasis (CanL) er en protozoisk infektion/sygdom forårsaget af Leishmania infantum (synonymer: Leishmania chagasi; Leishmania infantum chagasi), der er meget udbredt i alle lande i Middelhavsområdet, Kaukasus og Mellemøsten i den gamle verden samt i flere latinamerikanske områder (Dantas-Torres et al., 2012). Infektionsresultater hos hunde varierer fra subklinisk til klinisk og fra mild til alvorlig sygdom. Selv om parasitten lejlighedsvis kan overføres ad ikke-vektorielle veje (EFSA Panel on Animal Health and Welfare, 2015), er den vigtigste smittevej bid fra inficerede phlebotomine-sandfluer. Fra ca. 7 dage efter et inficeret blodmåltid kan kompetente vektorer udvikle infektiøse Leishmania-promastigoter i forspjældet, som regurgiteres ind i pattedyrværtens hud under det efterfølgende blodmåltid (Bates, 2007). Både subkliniske og syge hunde kan være smitsomme for vektorer; sandsynligheden for at bidrage uforholdsmæssigt meget til videreoverførsel (“super-spreder”-effekt) øges dog med varigheden og sværhedsgraden af CanL (Courtenay et al., 2014).

Phlebotomus perniciosus er den vigtigste kompetente vektor for L. infantum i hele det vestlige Middelhavsområde, herunder Sydeuropa og det nordvestlige Afrika (Det Europæiske Center for Forebyggelse af og Kontrol med Sygdomme, 2019). Desuden er P. perniciosus et repræsentativt medlem af en større taksonomisk gruppe, Larroussius subgenus, der består af morfologisk, genetisk og biologisk nært beslægtede arter, der fungerer som kompetente vektorer af L. infantum i det centrale og østlige Middelhavsområde, såsom Phlebotomus neglectus og Phlebotomus tobbi (Alten et al., 2016). Brugen af topiske pyrethroider anses universelt for at være den første linje til at beskytte raske hunde mod Leishmania-inficerede sandfluebid (Maroli et al., 2010), mens håndteringen af inficerede/inficerede hunde er en kompleks opgave på grund af manglen på en bred konsensus med hensyn til den tilgang, der skal anvendes. Ideelt set bør individuel dyrlægebehandling til håndtering af CanL-patologi kombineres med foranstaltninger, der har til formål at forhindre parasitten i at blive spredt via vektoren. Sidstnævnte er særlig vigtigt som en del af de zoonotiske VL-kontrolprogrammer, der i øjeblikket gennemføres i flere endemiske lande. På den ene side er ejerne tilbageholdende med at investere i pyrethroidprodukter til hunde, der allerede er inficeret eller syge; på den anden side har antileishmaniale behandlinger kun midlertidig effektivitet til konsekvent at reducere en hunds smittefarlighed over for sandfluer (Miró et al., 2017). Isoxazoliner er en ny klasse af forbindelser, der er målrettet mod det centrale nervesystem og neuromuskulære kryds hos leddyr vektorer ved at blokere ligand-gated chloridkanaler og dermed forårsage leddyrets død (Weber & Selzer, 2016). En række forbindelser er blevet godkendt som veterinærlægemidler til beskyttelse af kæledyr mod lopper og flåter med lange in vivohalveringstider, der giver uger til måneder af beskyttelse efter en enkelt oral indgift (Kilp et al., 2014; Shoop et al., 2014). Disse egenskaber tiltrak sig opmærksomhed om den potentielle anvendelse af isoxazoliner til bekæmpelse af vektorbårne sygdomme hos mennesker (Miglianico et al., 2018). Med hensyn til flyvende insekter blev både graden og varigheden af den insekticide effekt fundet forskellig blandt kommercielt tilgængelige isoxazoliner, når de blev administreret til hunde, f.eks. mod Triatoma infestans (Loza et al., 2017) eller sandfluen Phlebotomus papatasi (Gomez et al., 2018a), hvor fluralaner (Bravecto®; Merck Animal Health) viste sig at være den mest aktive forbindelse med hensyn til de ovennævnte effektivitetsparametre. For nylig blev der i et klinisk forsøg med fluralanerbehandling af hunde mod sandfluer gjort brug af koloniseret P. papatasi som målart (Gomez et al., 2018b). Denne art kan dog ikke anses for at være en egnet sandflue-model. Dette skyldes primært, at P. papatasi ikke er en kompetent vektor af L. infantum, idet den er refraktær over for tarmudvikling af denne parasit. Desuden tyder tidligere undersøgelser af topiske pyrethroider til hunde (Maroli et al., 2010) på, at P. papatasi måske er mindre modtagelig over for forbindelser, der er rettet mod sandfluens centralnervesystem, end P. perniciosus. For eksempel dræbte en spot-on-formulering med 50 % permethrin-10 % imidacloprid 29 % P. papatasi mod 49 % P. perniciosus. Disse overvejelser fik os til at bestemme indtræden og varighed af den insekticide virkning mod P. perniciosus efter fodring af fluralanerbehandlede hunde.

Der blev udført en parallelgruppedesignet, negativ-kontrolleret, randomiseret, blindet, single-center effektundersøgelse. Forsøgshunde, bestående af hanbeagler ≥ 6 måneder gamle på inklusionstidspunktet, kom fra en forskningskoloni i Mohammedia, Marokko; undersøgelsen i livsfasen blev udført på Clinvet-anlæggene. Voksne P. perniciosus-eksemplarer var fra en spansk stamme, der fra juni 2012 og fremefter blev vedligeholdt på de medicinske entomologiske faciliteter i Istituto Superiore di Sanità, Italien, ved 28 ± 1 °C og 75-80 % relativ luftfugtighed. Sandfluerne blev certificeret patogenfri og tilpasset til masseavlsbetingelser med seks uafhængige koloniunderlinjer. De tre til ni dage gamle eksemplarer blev samlet fra de respektive bure og fordelt i samme aldersforhold i cylindriske plastpotter (400 mL) med et tæt låg, som blev perforeret og hullet dækket med en fin gaze med et stykke bomuld, der var gennemvædet af en glukosemættet opløsning. Antallet af sandfluer i hver potte var tilstrækkeligt til én hund, idet der blev tilføjet et par ekstra eksemplarer for at kompensere for dødsfald, der indtraf før forsøgene. Potterne blev anbragt i lufttætte plastposer forsynet med befugtet filterpapir. Den sekundære emballage bestod af en forvarmet beholder forsynet med en udvidet temperaturstabilitetsanordning og en digital temperaturregistrator, omgivet af en robust kartonboks. Kasserne blev sendt til Marokko med fly, og leveringen fandt sted ca. 3 dage efter forsendelsen. Ved leveringen blev temperaturregistreringen kontrolleret, og plastikposerne blev efterladt uåbnede ved 25 ± 3 °C, indtil hundene blev eksponeret. Der blev foretaget en grov vurdering af sandflue-dødeligheden i potterne udefra, og en dødelighed på ≤ 10 % pr. potte blev anset for at være acceptabel til brug. I sidste ende blev hver hund på forsøgstidspunktet udsat for den samme homogene population af sandfluer, der var 7-14 dage gamle.

Syvogtyve dage før behandlingen blev 14 han Beagle-hunde bedøvet med Domitor® (Vetoquinol, Lure, Frankrig), og deres hoved blev i 1 time udsat for bid fra ca. 40 hunner af P. perniciosus i bur sammen med fem hanner for at fremme bidadfærd med henblik på at vurdere den individuelle tiltrækningskraft for vektoren under disse forsøgsbetingelser. Hundene blev rangeret i faldende rækkefølge på grundlag af antallet af levende blodfødeprøver; to hunde med det laveste antal blev udelukket fra undersøgelsen, og 12 hunde blev inkluderet og fordelt på to grupper på hver seks hunde (gruppe 1 og 2). På dag 0 blev hunde i gruppe 2 behandlet med en oral dosis fluralaner (Bravecto® tyggetabletter) i en dosis på 25 til 56 mg/kg legemsvægt, mens hunde i gruppe 1 forblev ubehandlede. Der blev foretaget specifikke sundhedsobservationer 1, 2 og 6 timer efter indgivelse af fluralaner til den sidste hund. Eksponeringen af hunde for ca. 40-60 P. perniciosus-hunner (plus 5-10 hanner) blev udført parallelt for begge grupper ved samme temperatur- og fugtighedsforhold i to rum på dag 1, 28 og 84 (oprindeligt blev der overvejet en midtvejsvurdering for perioden omkring 50-60 dage efter behandlingen, men dette var ikke muligt på grund af tekniske og logistiske problemer). Det primære kriterium for bestemmelse af virkningen var overlevelsesraten for sandfluer, der var fuldt fodret med behandlede hunde, i forhold til dem, der var fuldt fodret med kontrolhunde, idet der ikke blev taget hensyn til delvist eller marginalt blodfodrede eksemplarer. For at muliggøre optimale og holdbare sammenligninger mellem de to grupper af sandflueeksemplarer blev hunnerne individuelt indsamlet fra eksponeringsbure ved hjælp af forsigtig mundpumpning og samlet i grupper på ≤ 10 eksemplarer i gipsbeklædte plastpotter. Krukkerne blev derefter anbragt i kasser med mættet glukose og befugtet filterpapir og blev derefter opbevaret ved 26 °C. Der blev foretaget levedygtighedsvurderinger efter 6 timer (undtagen dag 1) og derefter med 24 timers mellemrum op til højst 96 timer efter afslutningen af eksponeringen. For at vurdere den generelle levedygtighed af det sandflueparti, der blev anvendt i hvert forsøg, blev de ovenfor beskrevne procedurer anvendt på både fodrede og ufodrede hunner.

Den statistiske signifikans af resultaterne af den insekticide virkning, udtrykt som andelen af levende fodrede sandflugtællinger fra gruppe 2 i forhold til dem fra gruppe 1, blev beregnet ved hjælp af en lineær blandet model, der omfattede undersøgelsesgruppen som en fast effekt og en randomiseringsblok som en tilfældig effekt, med signifikansniveauet sat til α = 0,05 (dobbeltsidet). Modellen anvendte Kenward-Rogers-justering til at bestemme frihedsgraderne i nævneren.

På dag 1 blev 78 blodfodrede prøver ud af i alt 159 levende hunner, der var indsamlet fra hunde i gruppe 2, vurderet mod 64 blodfodrede prøver/169 levende hunner fra hunde i gruppe 1. På dag 28 var de blodfodrede prøver 199/341 levende hunner fra gruppe 2, som blev vurderet mod 146/310 fra gruppe 1. På dag 84 var de blodfodrede prøver henholdsvis 240/326 fra gruppe 2 og 206/339 fra gruppe 1. Tabel 1 viser de gennemsnitlige andele af overlevende P. perniciosus efter indtagelse af et blodmåltid på behandlede og ubehandlede hunde. På dag 1 efter behandlingen var der tegn på nogle dødsfald blandt de sandsvirrefluer, der allerede var blevet opsamlet fra eksponeringsbure i gruppe 2, men ikke blandt dem i gruppe 1. Efter 24 timer var alle blodfodrede eksemplarer fra gruppe 2 døde i modsætning til 11 % af de blodfodrede eksemplarer fra gruppe 1. På dag 28 var overlevelsen af eksemplarer, der blev fodret med hunde fra gruppe 2, betydeligt lavere end hos eksemplarer fra gruppe 1 allerede 6 timer efter blodmåltidet; igen var alle blodfodrede eksemplarer fra gruppe 2 døde efter 24 timer, i modsætning til 3 % af de blodfodrede eksemplarer fra gruppe 1. På dag 84 overlevede et antal eksemplarer, der havde spist af behandlede hunde, indtil observationernes afslutning, med store variationer inden for grupperne; deres overlevelsesrate faldt fra 24 timer og var betydeligt lavere fra 48 timer og fremefter sammenlignet med eksemplarer, der havde spist af kontrolhunde, med en beregnet insekticid aktivitet på over 50 % op til 96 timers observation.

Overlevelsesprocenten af ufodrede sandfluer, der blev indsamlet fra eksponeringsbure, blev også evalueret op til 96 timer efter eksponeringen af hver hund. De var generelt forhøjede og højere sammenlignet med dem i blodfodrede eksemplarer og viste nogle forskelle mellem de enkelte dage af en hunds eksponering, om end ikke så meget mellem forsøgsgrupperne i hver eksponering. Dette kan afspejle variationer fra batch til batch i dødeligheden, der typisk forekommer mellem generationer af koloniserede sandfluer, og muligvis forskellige transportbetingelser. Indtagelse af blod var den eneste variabel, der var forbundet med 100 % sandflue-dødelighed hos fluralaner-behandlede hunde (Fig. 1).

Denne undersøgelse giver, selv om den ikke sammenligner forskellige sandfluearter, yderligere beviser for, at modtageligheden over for insekticidprodukter til hunde, der er rettet mod sandfluens centralnervesystem, kan være større hos P. perniciosus end hos P. papatasi. Ved anvendelse af den samme fluralanerformulering og doser i en undersøgelse, der omfattede Beagles, som blev udsat for denne art, registrerede Gomez et al. (2018b) delvis overlevelse af blodfodrede P. papatasi-hunner (i størrelsesordenen 6-7 %) allerede 17-31 dage efter behandlingen, hvilket steg til ca. 25 % på dag 45.

Der er > 5 dages forsinkelsesperiode for en sandflue til at være smitsom efter indtagelse af et inficeret blodmåltid. Der er derfor en teknisk udfordring i forbindelse med undersøgelser af systemiske insekticider i sandfluer med hensyn til at opretholde en høj og varig overlevelse af blodfodrede kontrolprøver og påvise eventuelle forsinkede insekticide virkninger, som stadig har et overførselshæmmende potentiale. Denne udfordring adskiller sig fra de mest almindelige undersøgelser med behandlinger mod fodring, hvor sandfluer dræbes af operatørerne umiddelbart efter eksponeringen af en hund og klassificeres som blodfødte/ikke blodfødte. Der er behov for langtidsevalueringer for at sikre en meningsfuld fortolkning og statistisk signifikans af overlevelsesforskellene mellem behandlede grupper og kontrolgrupper (f.eks. under nedadgående fase-koncentrationer af lægemidler i hundeplasmaet). Brugen af ex vivo hundeblod fra både behandlede og kontrolhunde i kunstige fodringssystemer kan være udsat for bakteriel kontaminering og dermed resultere i hurtig død af eventuelle engorgede sandfluer, hvilket kun giver mulighed for et smalt tidsmæssigt vindue til at skelne mellem aktive og ikke-aktive lægemidler (Gomez et al., 2018a). I den foreliggende undersøgelse var overlevelsesraten for blodfodrede kontrolprøver meget tilfredsstillende med et interval på 61-81 % ved 96 timer efter blodmåltidet.

Farmakokinetikken af fluralaner i hundeplasma efter en enkelt oral indgift viste en regelmæssig faldende tendens op til ca. 100 dage efter behandlingen, hvor den bliver udetekterbar (Kilp et al., 2014). Det er interessant at bemærke, at et teoretisk middelområde på ca. 40-100 ng fluralaner/mL plasma, svarende til 84 dage efter behandling, stadig var i stand til at dræbe > 50 % af P. perniciosus inden for 48 timer efter et blodmåltid. Derfor er det sandsynligt, at mellemliggende plasmakoncentrationer, såsom dem, der forventes mellem 28 og 84 dage efter behandlingen, også vil give forhøjet insekticid aktivitet mod vektoren, og derfor er der behov for nye undersøgelser for at bekræfte dette. På den anden side viser resultaterne af den foreliggende undersøgelse med hensyn til de tre tidspunkter klart en sammenhængende tendens til reduktion af virkningen gennem hele undersøgelsen.

Konklusionen er, at fluralanerbehandling af hunde udgør en lovende metode til at reducere puljen af inficerede vektorer i endemiske omgivelser med zoonotisk VL. Desuden kan brugen af fluralaner i kombination med forebyggende topiske pyrethroidbehandlinger, forudsat at dette ikke er kontraindiceret af hensyn til hundens sikkerhed (Walther et al., 2014), give fordele for hunde i højrisikoområder.