Introduktion

Virvler er et karakteristisk træk ved hvirveldyrenes kropsplan. Et hvirvleskelet kan bestå af en række parvise neuralbuer, der dækker rygmarven, parvise hæmalbuer, der omslutter den caudale arterie og vene, og hos mange hvirveldyr med kæber (gnathostomer) en række centra, der erstatter notochorden som den fremherskende støttestruktur. Hvirvelcentrene er meget variable med hensyn til morfologi og vævssammensætning og har sandsynligvis udviklet sig uafhængigt af hinanden i mange forskellige gnathostome-slægter, herunder tetrapoder, teleostfisk og bruskfisk . Denne tilsyneladende evolutionære konvergens rejser spørgsmål om den embryonale oprindelse af vertebrale skeletelementer på tværs af gnathostomer.

I tetrapoder stammer alle komponenter af det vertebrale skelet fra somitter: forbigående, bilaterale blokke af segmenteret paraxial mesoderm, der dannes dorsalt i den embryonale stamme. Somitterne er opdelt i dorsale og ventrale underopdelinger, der giver anledning til henholdsvis bindevæv og muskulatur i stammen (“dermomyotome”) og skeletvæv (“sclerotome”). Eksperimenter til sporing af cellelinjen ved hjælp af kyllingehøne-chimærer og fluorescein-dextran-injektioner eller transplantationer fra GFP-transgene donorembryoner i axolotl har vist en fuldstændig somitisk oprindelse af rygskelettet hos disse taxa, med somitisk afledte celler, der genfindes i udviklende buer og begyndende brusk i centra.

Omvendt ser det ud til, at rygskelettet hos teleoste strålefinnede fisk har en dobbelt embryonal oprindelse med bidrag fra både paraxial mesoderm og notochordet. Teleost hvirvelcentrene består af et indre lag (chordacentrum) og et ydre lag, der begge består af knogle, som dannes ved intramembranøs forbening . Teleosternes chordacentrum dannes først ved sekretion af knoglematrixproteiner (f.eks. SPARC, type I kollagen) fra “chordoblast”-celler, der befinder sig i notochord-epithelet . Hos zebrafisk har in vitro-forsøg vist, at dyrkede notochordceller har kapacitet til at udskille knoglematrix, og ablationseksperimenter har vist, at der ikke dannes chordacentra i mangel af notochord . Teleost-chordacentra er efterfølgende omgivet af et relativt sent udviklende lag af membranben, der stammer fra paraxial mesoderm . Desuden har zebrafiskmutanter med somitmønsterdefekter normalt udviklede chordacentra, men udviser dybtgående neural- og hæmalbuefejl, hvilket tyder på, at buevævets oprindelse sandsynligvis er paraxial mesodermal .

For at afgøre, om den dobbelte oprindelse af vertebrale centra er et teleost-specifikt træk ved rygskelettet eller et generelt træk for gnathostomer, der er gået tabt i tetrapoder, er der behov for data om den embryonale oprindelse af hvirvler fra en outgroup til de benede fisk (dvs. Osteichthyes: den gruppe, der omfatter tetrapoder og teleoste). Bruskfisk (Chondrichthyes: hajer, rokker og holocephalaer) indtager en central fylogenetisk position som søstergruppe til benfiskene, og data fra denne slægt kan derfor bruges til at udlede primitive udviklingsbetingelser for den sidste fælles forfader til gnathostomerne. Vi har tidligere vist, at ryghvirvlerne hos den lille rokke (Leucoraja erinacea) hver består af en dorsal neural rygsøjle, to sæt dorsalbrusk, der omslutter rygmarven (neural- og interkalærbuer), en enkelt hæmal bue og rygsøjle, der strækker sig ventralt, og et trelagscentrum (figur 1) . Her bruger vi somit- og notochord-skæbnekortlægningseksperimenter samt mRNA-in-situ-hybridisering for gener, der koder for skeletmatrixproteiner, til at teste den embryonale oprindelse af rokkehvirvelsskelettet. Vi viser, at alle komponenter af rokkehvirvelskeletet stammer fra paraxial mesoderm, uden beviser for cellulære eller matrixbidrag fra notokorden. Når de betragtes sammen med data fra benede fisk, peger vores resultater på en generel og sandsynligvis primitiv paraxial mesodermal oprindelse af hvirveldyrsøjlen hos hvirveldyr med kæber.

Materiale og metoder

(a) Somit skæbnekortlægning

Leucoraja erinacea embryoner blev indhentet fra Marine Biological Laboratory (MBL) i Woods Hole, MA, og opbevaret i et gennemstrømningshavbord ved ca. 16°C indtil S24. Der blev skåret en klap i ægget med et barberblad, og embryonet og æggeblommen blev overført til en petriskål. Embryoerne blev bedøvet i en opløsning af MS-222 (100 mg l-1 ethyl 3-aminobenzoat methanesulfonat-Sigma-Aldrich) i havvand. CellTracker CM-DiI (Thermofisher) (5 µg µl-1 i ethanol) blev fortyndet 1 : 10 i 0,3 M saccharose og injiceret i de ventrale dele af somitterne (en til tre injektioner pr. embryo) ved hjælp af en trukket glaskapillærnål og en Picospritzer-trykinjektor (figur 2a). Embryoerne blev derefter anbragt i deres æggebakker og returneret til havbordet for at udvikle sig i ca. 7 eller 12 uger. Embryoerne blev derefter fikseret med 4% PFA, som beskrevet i Criswell et al. .

(b) Kortlægning af notochord-skæbne

Embryoner blev opbevaret som beskrevet ovenfor indtil S14, hvorefter der blev skåret et lille vindue i æggeskallen over embryoet. CM-DiI blev mikroinjiceret ind i notokordtrianglen som beskrevet ovenfor (figur 2b). Vinduet blev derefter forseglet med donorægskallen og Krazy Glue™-gel (figur 2c), og æggene blev returneret til havbordet for at udvikle sig i yderligere 16-18 uger inden fiksering (som beskrevet i Criswell et al. ).

(c) Validering af CM-DiI-injektionsplacering

For at verificere den korrekte placering af CM-DiI-injektionerne blev tre somit-injicerede embryoner fikseret umiddelbart efter injektionen, og tre notokord-injicerede embryoner blev fikseret 5 dage efter injektionen (dpi). Embryoerne blev fikseret i 4 % paraformaldehyd i PBS natten over ved 4 °C, skyllet 3 × 15 min. i PBS og farvet med DAPI på 1 µg ml-1 natten over ved stuetemperatur. Somit-injicerede embryoner blev afbildet på et Zeiss lightsheet-mikroskop og ikke-chord-injicerede embryoner blev afbildet på Zeiss lightsheet eller LSM 780 konfokale mikroskoper.

(d) Histologi og mRNA in situ hybridisering

CM-DiI-mærkede L. erinacea embryoner blev indlejret i paraffinvoks og skåret i 8 µm tykkelse som beskrevet i O’Neill et al. med henblik på histologisk analyse. Før indlejring blev embryoner demineraliseret i 10% EDTA (ethylendiaminetetraeddikesyre) i 14 dage. Histokemisk farvning blev udført efter Massons trichrome-protokol af Witten og Hall . In situ hybridiseringseksperimenter for Col1a1 (GenBank accession nummer MG017616) og SPARC (GenBank accession nummer MG017615) blev udført på sektioner som beskrevet i O’Neill et al. , med modifikationer i henhold til Gillis et al. .

Resultater

(a) Somitisk bidrag til alle komponenter af rokkehvirvelskeletet

For at teste for somitisk bidrag til rokkehvirvelskeletet mikroinjicerede vi CM-DiI i ventrale dele af somitterne (dvs. det formodede sclerotom-figur 3a) af rokkeembryoner på stadium (S) 24 (Ballard et al. ). Fokal mærkning af somitterne (uden notokordisk forurening) blev bekræftet ved lysarkmikroskopi i embryoner, der blev fikseret umiddelbart efter injektionen (figur 3b; n = 3). Ved 50-52 dpi (S31) omgiver spindelformede celler i det udviklende areolarvæv i centrum notochordet, og præskeletalt mesenchym har kondenseret sig omkring neuralrøret og den caudale arterie og vene. I alle embryoner, der blev analyseret på dette stadium (n = 5), blev CM-DiI genfundet i de spindelformede celler i det areolære væv under udvikling (figur 3c), hvilket indikerer deres somitiske oprindelse.

Med 109 dpi (S34) er ryghvirvlerne fuldt udviklede med neural-, interkalær- og hæmalbuer og et centrum i tre lag (figur 1). I embryoner, der blev analyseret på dette stadium (n = 4), blev der fundet CM-DiI-positive celler i hele rygskelettet. Der blev fundet CM-DiI-positive celler i brusk i neural- (n = 3 ryghvirvler i tre embryoner) og hæmalbuen (n = 6 ryghvirvler i fire embryoner; figur 3d,e) samt i det indre lag af brusk (figur 3f); n = 2 ryghvirvler i to embryoner), det midterste areolære væv (figur 3g; n = 3 ryghvirvler i tre embryoner) og det ydre brusk i centrum (figur 3h; n = 3 ryghvirvler i tre embryoner). Samlet set viser disse resultater somitisk bidrag til alle hovedkomponenterne i rokkehvirvelsskelettet.

(b) Ingen beviser for notokordisk bidrag til hvirvelsskelettet hos rokke

For at teste for cellulære bidrag fra notokorden til rokkehvirvelsskelettet udførte vi en række notokordiske fate-mapping-eksperimenter. Hos bruskfisk stammer notochordet fra et lille trekantet område med stamceller (notochordtrekanten), som fremkommer ved den bageste kant af blastodiskens bagkant ved S12 . Vi markerede notokord-trekanten af rokkeembryoner med CM-DiI ved S14 (figur 4a), og vi bekræftede lokaliseringen af farvestoffet til notokorden ved 5 dpi (ca. S17) ved hjælp af konfokal mikroskopi. I tre embryoner, der blev undersøgt ved S17, blev CM-DiI fundet enten kun i notokorden (n = 2) eller i notokorden og neuralt væv (n = 1) (figur 4b). I ingen tilfælde blev der fundet CM-DiI-mærkede celler i det paraxiale mesoderm.

Vi mærkede derfor notochordtrevlerne på flere rokkeembryoner ved S14 og opdrættede disse embryoner til 116-129 dpi (S34 – på hvilket tidspunkt rygskeletet er fuldt differentieret). CM-DiI blev genfundet i notokorden (figur 4c,c′) og notokordenepitelet (figur 4d,d′) i de intervertebrale regioner i aksesøjlen (n = 5). Hos tre embryoner blev der fundet CM-DiI-positive celler i de rester af notochord-epithel, der fortsat findes i centrum af centrum, hvor notochordet næsten helt er erstattet af centrumbrusk i det indre lag, men der blev ikke fundet CM-DiI-positive chondrocytter i selve det indre lag brusk. Der blev ikke observeret CM-DiI-mærkede chondrocytter i nogen andre komponenter af den aksiale søjle. Disse eksperimenter giver derfor ingen beviser for et cellulært bidrag fra notochorden til rygskelettet.

I teleoste udskiller chordoblastceller i notochordepithelet matrixkomponenter, der udgør den acellulære knogle i chordacentrum. Selv om rokker ikke har et chordacentrum, mineraliseres areolarvævet i rokkecentret, og ved dets oprindelse sidder det ved siden af notochord-epithelet . For at teste, om notochord epithelceller bidrager med matrixkomponenter til centrumvævet hos rokke, karakteriserede vi ekspressionen af gener, der koder for knoglematrixproteinerne Col1a1 og SPARC i rokkecentra under udvikling. Vi påviste ikke transkription af Col1a1 (figur 5a) eller SPARC (figur 5b) i notochordenepitelet. Disse transkriptioner blev snarere lokaliseret til de spindelformede celler i det areolære væv (figur 5a,b). Disse resultater tyder på, at de paraxiale mesoderm-afledte celler i selve areolvævet – og ikke notochord-epitelet – er kilden til den ekstracellulære matrix i det mineraliserede væv i rokkehvirvelcentrum.

Diskussion

Vores eksperimenter med kortlægning af somiternes skæbne viser, at det formodede sclerotom bidrager til alle komponenter af hvirvlerne hos rokke, herunder neural- og hæmalbuen og alle væv i det trelagede hvirvelcentrum. Selv om det er muligt, at DiI kan diffundere gennem den ekstracellulære matrix efter injektion og kontaminere væv ved siden af det tilsigtede mål (f.eks. notochord), har vi kontrolleret denne mulighed ved at tage billeder af en delmængde af embryoner kort efter injektion for at validere præcisionen af vores mærkning og ved at udføre supplerende eksperimenter med kortlægning af notochords skæbne. I sidstnævnte forsøg fandt vi, at CM-DiI-mærkning af notochord-progenitorceller udelukkende resulterede i mærkning af notochordet og notochord-epitelet uden bidrag til hvirvelvæv. Hos teleostfisk udtrykker chordoblastceller i notochord-epithelet gener, der koder for knoglematrixproteinerne type I kollagen og SPARC , og de er sandsynligvis kilden til knoglematrix for det tidligste lag af hvirvelcentrum . Da rokker også har et mineraliseret lag i deres hvirvelcentrum, søgte vi at teste for ekspression af Col1a1 og SPARC under rokkehvirvelens udvikling ved hjælp af mRNA-in situ-hybridisering. Vi fandt, at disse gener udelukkende udtrykkes i de somitisk afledte spindelformede celler i areolarvævet (forløberen for det mineraliserede midterste lag i centrum – Criswell et al. ) og ikke i notokord-epithelet. Disse fund tyder på, at cellerne og matrixkomponenterne i rokkehvirvelcentrum er udelukkende af paraxial mesodermal oprindelse.

Sammenholdt med data fra benede fisk tyder vores påvisning af en somitisk oprindelse af rokkehvirvelskeletet på, at dette væv sandsynligvis var den eneste, primitive kilde til hvirvelskeletvæv i gnathostomer, med et notokordbidrag til centrumbenet, der repræsenterer en afledt tilstand hos teleostfisk (figur 6). Beviser fra tidlige fossile fisk med og uden kæbe tyder stærkt på, at rygskelettet hos gnathostomernes sidste fælles forfader blot bestod af en række neuralbuer og en vedvarende notochord, uden centra . Flere gnathostome slægter, herunder elasmobranchiske bruskfisk, teleostere og tetrapoder, udviklede efterfølgende centra uafhængigt af hinanden . Ved deres oprindelse stammede hvirvelcentrene hos elasmobranches og tetrapoder udelukkende fra paraxial mesoderm , men et indre lag af acellulær knogle, der stammer fra notochordet, blev inkorporeret i centret med den uafhængige oprindelse af teleostcentrene.

Det er dog endnu ikke klart, om denne specialiserede tilstand hos teleosterne er unik blandt strålefinnede fisk. På trods af nylige ændringer i fylogenetiske mønstre , udviklede vertebrale centra sig meget sandsynligt uafhængigt af hinanden i flere ikke-teleost strålefinnede fiskeslægter (f.eks. hos gars og bichirer ). Men det er uklart, om notochordet bidrager med væv til de forskellige former for centra, der er observeret hos disse taxa. Der er behov for omfattende analyser af den embryonale oprindelse af hvirvelvæv i strategisk udvalgte fisketaxa for bedre at kunne opklare den evolutionære og udviklingsmæssige samling af den forskelligartede vifte af aksiale skeletter, som vel nok er det vigtigste kendetegn, for hvirveldyr generelt.

Etik

Alt eksperimentelt arbejde blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af Animal Care and Use Committee ved MBL.

Datatilgængelighed

Sekvensdataene i forbindelse med generne i denne undersøgelse er tilgængelige på GenBank (Col1a1-adgangsnummer MG017616 og SPARC-adgangsnummer MG017615).

Autors bidrag

K.E.C. udformede undersøgelsen, udførte histologi, skæbnekortlægning og in situ hybridiseringseksperimenter og udarbejdede manuskriptet; M.I.C. koordinerede undersøgelsen og gav input til manuskriptet; J.A.G. udformede dele af undersøgelsen, koordinerede undersøgelsen og hjalp med at skrive manuskriptet. Alle forfattere gav den endelige godkendelse til offentliggørelse.

Konkurrerende interesser

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Finansiering

Denne undersøgelse blev støttet af en DDIG fra National Science Foundation (DEB 1501749), en University of Chicago/Marine Biological Laboratory Graduate Student Research Award, et Company of Biologists Travelling Fellowship og et Royal Society-Shooter International Fellowship (NF160762) til K.E.C.; et Royal Society University Research Fellowship (UF130182), et Isaac Newton Trust Grant (14.23z) og Marine Biological Laboratory Plum Foundation John E. Dowling og Laura and Arthur Colwin Research Fellowships til J.A.G.; og et stipendium fra National Science Foundation (DEB 1541491) og forskningsmidler fra University of Chicago til M.I.C.

Footnotes