Den fremkomsten af “præcisionsmedicin” er kendetegnet ved mange nye forbedringer af diagnostiske, prognostiske og terapeutiske metoder og behandlinger. Som en del af dette initiativ har der været fokus på at minimere den mængde væv, der er nødvendig til testning, via mindre invasive og mere sikre procedurer. En metode, der har vakt stor interesse i de seneste år, er “flydende biopsi”. Selv om definitionerne varierer med hensyn til den præcise betydning af dette begreb, kan det i store træk forstås som indsamling af en prøve af en kropsvæske til testning for relevante biomarkører med henblik på at informere om patientens behandling. Det anvendes oftest på indsamling af perifert blod med henblik på analyse af cellefri cirkulerende tumor deoxyribonukleinsyrer (DNA)
Den første beskrivelse af cirkulerende DNA uden celler i menneskeblod fandt sted i 1948, men dette vakte kun ringe opmærksomhed i det bredere videnskabelige samfund 2. I 1977 identificerede forskere tilstedeværelsen af unormalt høje niveauer af cellefrit DNA (cfDNA) i plasma og serum fra kræftpatienter i forhold til raske kontrolpatienter, og dette cfDNA blev formodet at repræsentere hovedsageligt cirkulerende tumor-DNA (ctDNA)1,5. Siden denne oprindelige beskrivelse har anden forskning vist, at øget cfDNA generelt afspejler en lang række patologiske processer, herunder maligne og godartede neoplastiske tilstande, inflammatoriske sygdomme, slagtilfælde, traumer og sepsis. Under disse processer kan nukleinsyrer udskilles i blodet af apoptotiske og nekrotiske celler eller ved kontrolleret udskillelse fra levende celler2,11. Mens cellefrit DNA ofte anvendes synonymt med cirkulerende tumor-DNA, bør man huske, at der også kan være cirkulerende ikke-tumor-DNA og ikke-humant DNA i en prøve.
Mens det nuværende fokus er domineret af DNA, omfatter yderligere komponenter i en væskebiopsi ribonukleinsyrer (RNA), cirkulerende tumorceller (CTC’er), ekstracellulære vesikler (EV’er) og tumoruddannede trombocytter (TEP’er). Sidstnævnte komponenter er hovedsagelig af forskningsmæssig interesse. Efterhånden som der udføres mere translationel forskning, kan disse yderligere komponenter i en væskebiopsi få stigende klinisk anvendelse i fremtiden. En gennemgang af disse elementer ligger uden for rammerne af denne artikel, og læseren henvises til artiklen af Batth et al. for yderligere læsning.
Teknologiske overvejelser
Sindtil for nylig har den tilgængelige teknologi ikke været følsom nok til at påvise ctDNA og anvende det til meningsfuld brug. I modsætning til molekylære analyser, der udføres på kropsvæsker til påvisning af nukleinsyrer fra virus og andre mikroorganismer, som nyder godt af relativt store mængder nukleinsyrer, er cirkulerende tumorkernes nukleinsyrefragmenter kun til stede i en brøkdel af det normale cfDNA uden for tumor. ctDNA er normalt små DNA-fragmenter i intervallet 140-170 basepar (bp)3 , og tumortype, progression, belastning, proliferationshastighed og terapi påvirker alle mængden af ctDNA i en prøve. Selv om ctDNA er relativt stabilt i plasma og serum, fjernes det desuden fra cirkulationen af leveren og nyrerne inden for få timer 3,4. Ikke desto mindre har fremskridt inden for præanalytiske processer og rensningsmetoder muliggjort en vellykket opsamling, forstærkning og sekventering af ctDNA.
Metoder, der i øjeblikket anvendes til påvisning eller måling af ctDNA, kan overordnet set opdeles i to kategorier: polymerasekædereaktion (PCR) baseret og næste generations sekventering (NGS) baseret. PCR-baserede assays har generelt en hurtigere gennemløbstid og er billigere, men kan typisk kun vurdere en eller få specifikke mutationer ad gangen (begrænset multiplexeringsmultiplikatorkapacitet). PCR-baserede metoder kan yderligere opdeles i metoder, der beriger for mutantsekvenser i forhold til vildtype (ikke-mutant), og metoder, der opnår kvantificering ved kompartmentalisering. Et eksempel på sidstnævnte gruppe er “digital PCR”, som er ved at blive almindeligt anvendt til påvisning og kvantificering af specifikke, kendte mutationer i ctDNA. PCR’en er opdelt i tusindvis af små individuelle reaktionsvolumener, enten på en chip eller ved at skabe vand-i-olie-dråber. Hvert rum eller dråbe indeholder enten et målrettet skabelonfragment eller ej og producerer et fluorescerende signal, hvis et passende skabelonfragment er til stede i det pågældende volumen. Ved at tælle de enkelte fluorescerende volumener er det muligt at vurdere antallet af specifikt målrettede skabelonmolekyler i prøven. For flere mål, der testes på én gang (multiplexing), kan forskellige fluorescerende signaler tildeles specifikke variantsekvenser.
Næste generations sekventeringsbaserede metoder muliggør vurdering af et meget bredere spektrum af mulige mutationer, fordi sekventering kan påvise mutationer, der forekommer overalt inden for de indfangede regioner. For at målrette mod mutationsprægede regioner af genomet kan NGS-biblioteker fremstilles fra plasma-DNA ved hjælp af enten ligations/hybridindfangningsmetoder eller målrettede PCR-berigelsesmetoder. Variantallelfraktionerne er generelt meget lavere i væskebiopsier end i vævsbiopsier, ofte <1 %, så de områder af interesse skal sekventeres dybere end ved NGS af primærtumorvæv. Desuden skal der foretages en omfattende optimering af de præanalytiske og analytiske processer for at maksimere inputprøven og reducere PCR- og sekventeringsfejl. NGS-tilgange har den vigtige fordel, at de kan opnå en meget bredere mutationsdækning (samtidig analyse af tusindvis af mulige mutationer). Der er således ikke behov for forudgående kendskab til tumorens specifikke mutationer. Sammenlignet med enklere PCR-baserede metoder er NGS-teknikker imidlertid dyrere, mere tidskrævende og mere teknisk udfordrende.
Fordele og ulemper
Fordelene ved væskebiopsier ligger overvejende i den langt mindre invasive karakter af procedurerne for at opnå dem i forhold til standardtumorbiopsier. Tænk f.eks. på den proces, der er forbundet med biopsi af en lungemasse. Hvis massen ligger på et sted, der er tilgængeligt ved interventionel radiologi eller kirurgisk biopsi, er der risiko for pneumothorax eller blødning, uanset omkostningerne ved at opretholde en operationssuite, hvor operationen kan udføres. Flydende biopsier gør det også muligt at foretage hyppigere og serielle prøvetagninger over tid for at opnå en bedre opløsning af tumorernes adfærd og deres reaktion på behandling. I en undersøgelse blev der f.eks. hos patienter med kolorektal cancer, som senere radiografisk viste et godt respons på behandlingen, konstateret et fald på >90 % af ctDNA-niveauerne efter de første 2 ugers behandling 9. Dette har vist sig at kunne stratificere risikoen for recidiv efter resektion med kurativ hensigt. I en anden undersøgelse havde brystkræftpatienter med påviseligt ctDNA efter resektion en 25 gange højere risiko for recidiv 10. Disse begreber svarer til den testning, der i øjeblikket foretages for hæmatologiske maligniteter, f.eks. kronisk myelogen leukæmi (CML) og seriel testning for tilstedeværelsen af BCR-ABL-fusionstranskripter. Endelig kan der i tilfælde, hvor en vævsbiopsi ikke er tilgængelig, stadig foretages molekylær profilering af tumorer via væskebiopsi.
Væsentlige ulemper ved væskebiopsi er bl.a., at der er behov for en indledende histologisk diagnose, som skal opnås ved vævsbiopsi. Laboratorier, der udfører disse analyser, skal være opmærksomme på passende testanvendelse og potentialet for “overfortolkning” i klinisk sammenhæng. Den lave variantfrekvens i det perifere blod kan føre til højere falsk-negative rater og kræve betydeligt større teknisk indsats og ekspertise for at opnå pålidelige resultater.
Aktuelle og nye anvendelser
Den kliniske anvendelse af væskebiopsi er steget betydeligt siden 2014, hvor den første kommercielt tilgængelige multigene-væskebiopsiplatform blev tilgængelig. Flere analyser er kommercielt tilgængelige og FDA-godkendte, og nogle af dem anses af forsikringsselskaberne for at være tilstrækkelige til at give ret til behandling. For eksempel godkendte FDA i 2016 cobas® EGFR Mutation Test v2 til at afgøre, om patienter med ikke-småcellet lungekræft er berettigede til at modtage visse EGFR tyrosinkinasehæmmere . Vedtagelsen af væskebiopsi til at udelukke patienter fra målrettet behandling har oplevet en langt langsommere klinisk vedtagelse, hovedsagelig på grund af bekymringer for falsk negative resultater og generelt tilgængeligt tumorvæv 3 . Den stigende kliniske anvendelse er også blevet drevet af patienter og læger, der ønsker at identificere målbare mutationer med henblik på off-label-anvendelse eller tilmelding til kliniske forsøg.
Nye anvendelser af væskebiopsier omfatter deres anvendelse som et supplement til vævsbiopsiens mutationsprofilering, vurdering af behandlingsrespons, overvågning af restsygdom, påvisning af sygdomsrecidiv og overvågning af fremkomsten af resistensmutationer 3 .
Fremtidige retninger
Den forventede kræftspecifikke karakter af mutationer gør ctDNA til en attraktiv biomarkør til tidlig påvisning af kræft, hvilket kunne have en enorm indvirkning på patientbehandlingen. Da tumorer i tidlige stadier imidlertid er kendt for at frigive meget lidt DNA, er der mange tekniske udfordringer, der skal overvindes. Selv om flydende biopsi kan være et attraktivt redskab til kræftscreening hos asymptomatiske patienter, skal sådanne anvendelser overvejes omhyggeligt og velovervejet for at undgå overdreven patientlidelse og omkostninger som følge af falske positive resultater. På kort sigt kan flydende biopsier være mere nyttige til at bekræfte malignitet hos patienter med allerede klinisk eller radiografisk synlige læsioner.
Slutning
Litteraturen med fokus på ctDNA-testning vokser og udvikler sig hurtigt. De igangværende undersøgelsesområder omfatter præ-analytiske processer, faktorer, der påvirker ctDNA-detektionsraten, og prospektive kliniske forsøg. Vi vil sandsynligvis se en mere udbredt rolle for ctDNA i den kliniske behandling, da fortsat forskning i CTC’er, cfDNA/RNA og ekstracellulære vesikler vil give øget opløsning til det øjebliksbillede af tumorstatus, der opnås gennem væskebiopsier 4.