Chaetomium-lignende svampe, der forårsager opportunistiske infektioner hos mennesker: en mulig rolle for ekstremotolerance

Identificering af filamentøse skimmelsvampe i det kliniske rutinelaboratorium er stadig hovedsagelig baseret på mikroskopisk undersøgelse af sporulerende kolonier. Svampe, der mangler sporokarper eller karakteristiske sporer, er vanskelige at identificere (Pounder et al. 2007; Santos et al. 2013). I den foreliggende undersøgelse blev 13 sterile eller ikke-diagnostiske stammer analyseret. På baggrund af fænotypiske træk blev isolaterne identificeret som Papulaspora-arter på grund af dannelsen af klumper eller bulbil-lignende strukturer (Vinod Mootha et al. 2012). Ved forsøg på at fremkalde sporulation ved hjælp af forskellige substrater og inkubationsbetingelser producerede nogle stammer små konidier på korte phialider, men disse konidier var stadig ikke diagnostisk anvendelige og kunne ikke bruges til artsidentifikation.

Med molekylær og fylogenetisk analyse af seks loci blev stammerne fundet at tilhøre tre nye arter, som er beskrevet i denne undersøgelse. To arter blev samlet med typearten af slægten Subramaniula, mens en art var søster til to beskrevne Chaetomium-arter. Både Subramaniula og Chaetomium er medlemmer af familien Chaetomiaceae (Sordariales). Medlemmerne af denne familie er karakteriseret ved dannelsen af ascosporer i deliquescerende asci inde i mere eller mindre udførligt ornamenterede perithecia (Whiteside 1961). Fænotypisk identifikation af arter i Chaetomiaceae afhænger for det meste af formen af ascomatalhårene, ascoma-pigmenteringen og -ornamenteringen samt ascosporernes form (Ames 1961; von Arx et al. 1984). De tre beskrevne arter i den foreliggende undersøgelse udviste usædvanlige morfologiske træk ved ikke at kunne danne seksuel reproduktion i ascomata. I stedet var der klynger af tykvæggede, mørkpigmenterede celler til stede. Det er uklart, om disse strukturer repræsenterede umodne perithecier (Davey et al. 2008). Inden for rammerne af den singulære nomenklatur for svampe (Taylor 2011) beskrives arterne her alligevel i seksuelle slægter på grundlag af deres fylogenetiske position inden for Chaetomiaceae.

De to nye arter, der klynger sig til Subramaniula, stammer fra kliniske kilder, for det meste øjen- eller hudinfektioner. Den koprofile slægt Subramaniula er på nuværende tidspunkt kendt fra to arter, der blev overført fra Achaetomium, nemlig S. irregularis og den generiske typeart, S. thielavioides (Cannon 1986; von Arx 1985; von Arx et al. 1978). Slægten Subramaniula er karakteriseret ved glatte, blege ascomata med brede apikale åbninger (Fig. 8), uden en kendt aseksuel morf. Cannon (1986) rapporterede “Nogle få hyfer med kæder af betydeligt opsvulmede celler, der producerer tyndvæggede kugleformede eller ellipsoide legemer med en diameter på op til 8 μm, men som muligvis ikke fungerer som formeringsorganer”. Nogle forfattere foreslog, at disse organer kan være relateret til denne svamps aseksuelle tilstand (Pastirčák og Pastirčáková 2009). Ved undersøgelsen af den tidligere type stamme af S. thielavioides (CBS 122.78) påviste vi kæder af hævede celler, men der blev ikke set tyndvæggede legemer. Sammenlignet med vores to nye Subramaniula-arter, hvor der blev observeret konidier, er det usandsynligt, at disse strukturer er konidier, men kan fungere som overlevelsesformeringsorganer. Subramaniula irregularis (syn. Achaetomiella irregulare) er beskrevet som morfologisk lig S. thielavioides med nogle forskelle i form og størrelse af ascosporer og pigmentering af ascomata, men der findes ingen levende kultur for denne art (Cannon 1986).

Subramaniula thielavioides er blevet isoleret fra en gødningsprøve fra Indien, mens S. irregularis kun er kendt fra jord i Sydafrika (Cannon 1986; von Arx et al. 1978). Indtil videre er der ikke blevet tilskrevet Subramaniula nogen infektion hos mennesker. Cannon (1986) rapporterede imidlertid om isolering af S. thielavioides fra en menneskelig negl, og interessant nok rapporterede han: “Medical mycologists should be aware of its existence” (medicinske mykologer bør være opmærksomme på dens eksistens). Med de to nyligt beskrevne kliniske arter bekræftes det, at slægten Subramaniula har et potentiale som en opportunistisk slægt, der i sidste ende kan forårsage hud-, øjen- og negleinfektioner. En uidentificeret stamme fra et hornhindeulcus offentliggjort af Vinod Mootha et al. (2012), CBS 123294, er i denne undersøgelse beskrevet som en ny art Subramaniula asteroides. Stammen blev genvundet fra en patient, der bar en kontaktlinse, og som blev såret med en wire, mens han arbejdede i en hestestald. Stamme dH 21571 vedrørte en keratitis, der opstod efter et øjentraume med et skarpt planteblad på en landbrugsmark i det tropiske Indien. To andre stammer fra USA stammede også fra hornhinde-sår. Yderligere to stammer fra øjeninfektioner i Spanien matchede med S. asteroides; CNM-CM 4314 blev isoleret fra hornhindeekssudat fra en 27-årig mandlig patient, CNM-CM 7482 stammede fra en endophthalmitis hos en 47-årig immunsupprimeret patient; der blev observeret hyphyae i glaslegemet, og patienten mistede øjet. Subramaniula asteroides synes således at have en stærk forbindelse med traumatiske øjeninfektioner. I løbet af denne undersøgelse blev en anden sekvens, der stammer fra et isolat (UTHSC 03-1315) fra hud fra en patient fra Saudi-Arabien, også identificeret som S. asteroides. Det eneste miljøisolat af S. asteroides stammede også fra Saudi-Arabien, nemlig fra sandet ørkenjord under kulbrintepåvirkning. Det blev genvundet ved toluenberigelse (Zhao et al. 2010), en metode designet til isolering af svampe, der vokser under giftige forhold.

Subramaniula obscura er beskrevet i denne artikel for en enkelt stamme fra en 53-årig mand fra Kuwait, der var til stede med en tåinfektion. Stammen blev oprindeligt identificeret som Chaetomium cuniculorum. Vi fandt, at stammer af C. cuniculorum er fylogenetisk beslægtet med S. obscura, da begge blev fundet i en enkelt, understøttet klade baseret på både ribosomal genanalyse (ML-BS/PP, 84 %/1,0) og multilocus-analyse af proteinkodende gener (ML-BS/PP, 100 %/0,99) (Fig. 2). Med ITS-sekventering og ved brug af et begrænset antal taxa kan det faktisk være vanskeligt at adskille de to arter. ITS-sekvensen af den tidligere type stamme af S. obscura, CBS 132916, viste 97 % lighed med C. cuniculorum-isolater. Sidstnævnte art menes at forekomme mest på gødning, og omkring halvdelen af C. cuniculorum-stammerne i CBS’ kultursamling stammer fra gødning fra planteædende dyr. ITS-sammenfaldet mellem S. obscura og S. thielavioides er 99,4 %, men de proteinkodende gener er konsekvent forskellige, og derfor er det berettiget at beskrive den nye art i Subramaniula.

Makro- og mikromorfologien af Subramaniula obscura ligner den af S. asteroides, bortset fra, at de celler, der danner klumperne hos S. obscura, er mere brunlige og afrundede, og hyferne er tykkere og med vorteagtige fremspring. Den mindste væksttemperatur for begge arter og for S. thielavioides er 6 °C, og de voksede alle meget godt over 40 °C, hvilket tyder på Subramaniula-arternes termotolerance. Optimal vækst var mellem 33 og 36 °C, og konsekvent overlevelse ved 37 °C angiver evnen til at vokse ved menneskets kropstemperatur som virulensfaktor (Revankar og Sutton 2010).

Identificering af Chaetomium anamorphosum-stammen CBS 137114 som en ny art, genvundet fra human peritonitis, blev i første omgang foretaget ved morfologisk sammenligning med beskrevne Papulaspora-arter. Denne stamme viste en vis lighed med Papulaspora nishigaharanas ved dannelse af aggregater af brunfarvede, tykvæggede celler samt ved produktion af phialoconidier (Watanabe 1991). Sammenligning af sekvenser af ITS og af D1/D2-regionen af 28S rRNA-genet i GenBank afslørede ingen homologi med nogen kendte sekventerede arter. Ved hjælp af den molekylære fylogenetiske metode var vi i stand til at løse dette isolats taksonomi som en nær slægtning til de ascosporulerende arter Chaetomium irregulare og C. fusisporum (fig. 1, 2 og 9). Den nyligt identificerede art adskilte sig fra C. irregulare og C. fusisporum, ikke kun i morfologi, men også i væksttemperaturen. Den optimale væksttemperatur for C. anamorphosum var 33-36 °C, og der blev stadig observeret vækst ved 40 °C, mens den optimale væksttemperatur for C. irregulare var 30 °C, og den var ude af stand til at vokse eller voksede kun svagt ved 40 °C. Chaetomium irregulare blev overført til slægten Achaetomium af Rodríguez et al. (2004). Ved sammenligning med slægtstypen Achaetomium globosum blev det imidlertid konstateret, at den er fjerntstående, og navnet Achaetomium irregulare er overflødigt. Taxonomien og nomenklaturen for den klade, der indeholder den nye art og andre Chaetomium spp. som parafyletiske til Subramaniula, er uklar på grund af den relativt store afstand til den generiske typeart, C. globosum. Desuden adskiller morfologien af ascomata, ascomatalhår, hvis de er til stede, og ascosporer hos arterne i denne klade sig fra C. globosum. Slægterne Chaetomium, Achaetomium, Subramaniula og Achaetomiella ligner hinanden morfologisk med kun få forskelle i tilstedeværelsen eller fraværet af ascomatalhår, ascomavæggen, ascosporernes farve og i væksthastighed (Cannon 1986). Disse karakterer er blevet stort set irrelevante på grund af tilgængeligheden af molekylære data. I afventning af en taksonomisk revision af Chaetomium opretholder vi den nuværende klassificering af klyngen inden for denne slægt, idet vi anerkender Subramaniula som en slægt, der er indlejret i Chaetomium.

På trods af det store antal beskrevne arter i Chaetomium og beslægtede arter, er der kun lidt kendt om deres molekylære taksonomi, og kun få arter er blevet sekventeret og er tilgængelige i offentlige databaser (Wang et al. 2014). De fleste af de tidligere undersøgelser var begrænset til sjældne arter, og fylogenien af de mere allestedsnærværende Chaetomium-arter er fortsat uopklaret (Asgari og Zare 2011; Lee og Hanlin 1999; Wang et al. 2014). For nylig blev tre nye arter i C. indicum-gruppen beskrevet på grundlag af molekylær analyse af fire gener (Wang et al. 2014). En anden molekylær undersøgelse af Chaetomium blev foretaget af Asgari og Zare (2011) i Iran ved hjælp af fylogenetisk analyse af tre gener, hvilket resulterede i afgrænsningen af seks nye arter. To af disse viste aseksuelle morfer, der ligner dem, der dannes af Chaetomium anamorphosum og af begge Subramaniula-arter, der er beskrevet i denne artikel. Chaetomium rectangulare Asgari og Zare (2011) tilhører C. globosum-gruppen, der er kendetegnet ved aseksuelle morfformer med phialider og konidier, der ligner vores nye arters meget. Dette kunne tyde på, at de nye arter på en eller anden måde har mistet deres evne til at danne seksuel frugtsætning og erstattet denne med en aseksuel sporulationsform. Sekventering af MAT-lokussen, der regulerer den seksuelle reproduktion, kan måske indikere, om de seksuelle morfer hos disse arter er fraværende eller undertrykt.

Dyregødning, forrådnende vegetabilsk materiale og jord er kendte naturlige levesteder for Chaetomium-, Subramaniula- og Papulaspora-arter. De Hoog et al. (2013b) bemærkede, at slægten Madurella er indlejret i Chaetomium, og at mange arter i Chaetomiaceae kombinerer dyndassociation med tørre klimatiske forhold. Ved at tilføje de tidligere uidentificerede ikke-ascosporulerende arter til Chaetomium er denne slægts rolle i sygdomme hos mennesker og dyr steget betydeligt. Chaetomium-infektioner og infektioner af arter, der klynger sig i Chaetomiums fylogenetiske træ, såsom Chaetomidium og Thielavia, er blevet rapporteret fra hud, hår og negle (Hubka et al. 2011; Kaliamurthy et al. 2011; Kaliamurthy et al. 2011; Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). Desuden er flere arter af Chaetomiaceae blevet rapporteret til at forårsage alvorlige opportunistiske infektioner hos immunsvækkede patienter (Al-Aidaroos et al. 2007; Guppy et al. 1998; Hoppin et al. 1983). Flere tilfælde af peritonitis svarende til vores i C. anamorphosum er blevet rapporteret hos immunsvækkede personer, som havde erhvervet infektionen under peritonealdialyse. Febré et al. (1999) isolerede C. globosum fra flasker med dialysevæske; peritonitis blev rapporteret af Baer et al. (2013). Et interessant tilfælde offentliggjort af Issa et al. (2013) vedrørte en peritonitis hos en immunkompetent kvinde fra Damam, Saudi-Arabien, forårsaget af en ukendt Chaetomium-art. Tilsyneladende er også immunkompetente personer i risiko for dybe infektioner med Chaetomium eller beslægtede svampe. Som eksempel kan nævnes et tilfælde af fatal cerebral phaeohyphomycosis forårsaget af Thielavia subthermophila, der blev rapporteret hos immunkompetente personer (Badali et al. 2011). Chaetomium atrobrunneum, C. perlucidum og C. strumarium blev nu betragtet som neurotrope arter, der forårsager alvorlige og livstruende infektioner (Abbott et al. 1995; Barron et al. 2003; Guppy et al. 1998). Det ser ud til, at medlemmer af Chaetomiaceae faktisk har et undervurderet klinisk potentiale, og der er et presserende behov for en revurdering af slægtens rolle i human patologi. Mange arters naturlige levested i tørre klimaer og deres overlevelse ved høje temperaturer øger sandsynligvis deres overlevelse i pattedyrs væv. C. anamorphosums evne til at vokse optimalt ved 36 °C, i modsætning til C. irregulare, er et godt eksempel herpå. Arterne er i stand til at bryde den termiske udelukkelseszone i menneskekroppen, og hvis der er immunosuppression eller andre immunologiske problemer, kan svampe fremstå som potentielle menneskelige patogener (Casadevall 2012).

På grund af identifikationsvanskeligheder på grundlag af fænotypiske kriterier kan nogle ældre tilfælde af Chaetomium- eller Subramaniula-arter fejlagtigt være blevet ignoreret eller rapporteret som tilfælde af Madurella- eller Papulaspora-infektion (Mohd-Tahir et al. 2012). Vores undersøgelser viser klart, at traumatiske og opportunistiske infektioner med Chaetomium-lignende arter ofte giver ikke- eller dårligt sprudlende stammer i kultur (Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). Beskrivelsen af disse stammer som separate taksonomiske enheder i slægten er vigtig både fra et klinisk og epidemiologisk synspunkt. Desuden er der kun få undersøgelser af antimykotikafølsomhed, og der er et presserende behov for behandlingsprotokoller.

Skriv et svar Annuller svar