Mänskliga deltagare

Experimenten i Spanien granskades och godkändes av etikkommittén vid universitetssjukhuset La Fe Valencia och följde Helsingforsde principerna i Helsingforsdeklarationen och ytterligare granskningar. Försöken i Berlin godkändes av den etiska kommittén vid Charité-Universitätsmedizin i Berlin (EA4/012/05). Två kohorter studerades: den ena bestod av 65 friska vuxna frivilliga och den andra av 16 patienter med Ushers syndrom (typ II) med olika trunkeringsmutationer i USH2A. Uppgifter från tre patienter utelämnades från denna studie på grund av att två patienter hade en tidigare diabetesdiagnos och en patient hade karpaltunnelsyndrom, vilket skulle kunna påverka de psykofysiska trösklarna. Deltagarna i studien testades med ett batteri bestående av nio psykofysiska tester som applicerades på huden. Alla deltagare fick skriftlig och muntlig information innan de deltog i studien och gav sitt skriftliga samtycke. Ingen av studiedeltagarna var <20 år gammal. Följande information om deltagarna dokumenterades: ålder, kön, handledarskap, hörapparater (hörapparater, cochleaimplantat), svårighetsgrad av döv- och blindhetssymptom samt komorbiditeter.

Mänsklig kvantitativ sensorisk testning

Psykofysisk testning utfördes i enlighet med det standardiserade testprotokollet för kvantitativ sensorisk testning av det tyska forskningsnätverket för neuropatisk smärta44. Vibrotaktila perceptuella trösklar vid olika frekvenser bestämdes med hjälp av en test med två val1,2. Anordningen bestod av en linjär piezoaktuator (Physik Instrumente, katalognummer P-602.1 L) vars förskjutningar drivs och styrs av en förstärkare/styrenhet (Physik Instrumente, katalognummer E-665). Signalerna bearbetades av datainsamlingssystemet PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments). Vibrationsstimulansen var 1,8 s lång och stignings- och falltiden vid start och förskjutning var 500 respektive 600 ms, oberoende av testfrekvens eller amplitud. Stimulans varaktighet mellan on- och offsetfaserna var 700 ms. En uppsättning vibrationsstimuli användes som skalades logaritmiskt mellan 18 nm och 45 μm. För vibrationstesterna med 10 Hz och 125 Hz sattes startamplituden till 7,18 μm respektive 2,84 μm. Vi mätte inte direkt sondens rörelse under de testförhållanden som användes. Denna piezoaktuator uppvisar hög tillförlitlighet, men amplituddämpning kan teoretiskt sett uppstå med förskjutningar med större amplitud nära aktuatorns maximala rörelseamplitud (35 µm). Alla deltagare uppvisade dock psykofysiska trösklar långt under 35 µm för alla testade frekvenser (fig. 1c). Observera att exakt samma apparat användes för mätning hos friska kontroller och deltagare med Ushers syndrom. Mekaniska vibrationsstimuli gavs till huden mellan nagelbädden och lillfingrets första led. Sonden var tillverkad av glas och hade ett platt, cirkulärt kontaktområde med en diameter på 5 mm, med en motvikt av mässing för att säkerställa att samma grad av hållkraft tillämpades på varje deltagare. Lillfingret på den dominerande handen testades över två frekvenser (10 Hz och 125 Hz; 1,8 s varaktighet). Deltagarna signalerade när de upptäckte ett vibrationsstimulans under ett av två tidsfönster genom att trycka på en knapp. Protokollet bestod av en upp-ner-design som ökade eller minskade stimulusets amplitud (mellan 18 nm och 45 µm), beroende på hur framgångsrik man var under uppgiften. Åtta upp-och-ner-amplitudvändningar (totalt ~40-80 individuella försök per session) runt den perceptuella tröskeln utfördes för att skapa en genomsnittlig perceptuell tröskel för varje patient. Amplituden för vibrationsstimuli som drivs av piezoenheten kalibrerades genom att mäta sondens förskjutningsamplitud under ett mikroskop till stegvisa spänningsstegringar.

Ett taktilt skärptest användes också för att testa gränserna för fingertoppens rumsliga upplösning (medianinnervation), med hjälp av ett orienteringstest med två intervaller, forcerat val, taktilt gallerorienteringstest med en kub för taktil skärpa, som bestod av sex sidor med galler med olika bredder (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 och 6,0 mm)1,2,3. Deltagarna hade förbundna ögon och kuben placerades i vertikal eller horisontell riktning mot deras fingertopp. Ett förfarande med två nedåt och ett uppåt tillämpades med 10-15 vändpunkter för grittingstorlek. Tröskelvärdena (71 % korrekt svar) beräknades som medianen från de sista 10 av 15 vändpunkterna2. Mekaniska detektionströsklar fastställdes med hjälp av en standardiserad uppsättning av 23 vFh-filament (Optihair3-Set) med krafter mellan 0,25 och 265 mN. VFhs applicerades i stigande ordning på handens dorsala sida (radiell innervation) under 1 s tills deltagaren uppfattade en taktil känsla. Ordningen vändes sedan till den punkt då deltagaren inte uppfattade någon taktil känsla. Den genomsnittliga kraften från fem omkastningar användes som tröskelvärde. Mekaniska smärttrösklar testades med en uppsättning av sju viktade pinprick-stimulatorer (MRC Systems) med spetsar på 0,25 mm och krafter mellan 8 och 512 mN. En enkel trappstegsmetod (en upp- och en ner-regel) utfördes där patienterna tillfrågades om stimulansen uppfattades som skarp som orsakade känslan av stickande smärta. Stimuli applicerades på den dorsala sidan av handen efter vFh-detektionsuppgifter. Tröskeln beräknades utifrån medelvärdet av fem omkastningar. Tröskelvärden för termisk varm- och kallperception samt tröskelvärden för varm- och kallsmärta testades med hjälp av en TSA II termosensorisk analysator (MEDOC). Termoden hade en yta på 9 cm2 , avgränsningstemperaturer mellan 0 och 50 °C och en temperaturförändringshastighet på 1 °C s-1. Termoden placerades på den volara sidan av den mellersta delen av underarmen (medial antebrachial innervation). Tre på varandra följande försök utfördes för varje termiskt test i följande ordning: kalldetektering, varmdetektering samt tröskelvärden för kall smärta och värmesmärta. Deltagarna i studien ombads ange vid vilken tidpunkt de började uppleva kylning, uppvärmning, kall- och värmesmärta. Tröskelvärdena var medeltemperaturen för de tre försöken i varje test.

Möss

Alla experiment godkändes av Berlins djurförsöksetiska kommitté (Landesamt für Gesundheit und Soziales) och utfördes i enlighet med europeisk djurskyddslagstiftning. Manliga och kvinnliga Ush2a-/–möss och kullkompisar av vildtyp (Ush2a+/+) från CBA/CaJ-bakgrund som var mellan 10 och 30 veckor gamla användes11. Alla anatomiska och elektrofysiologiska experiment utfördes på ungefär lika många hon- och hanmöss. För vibrationsdetekteringsuppgiften användes endast honmöss. Alla möss hölls på en 12 timmars ljus:12 timmars mörkcykel.

Musvävnadsanatomi och immunohistokemi

För immunohistokemi av huden avlivades mössen genom CO2-inhalation i 2-4 minuter följt av cervikal dislokation, och tassens hudvävnad dissekerades och hypodermis, ligament och fäst muskelvävnad avlägsnades. Hudproverna sträcktes ut med hjälp av insektsnålar och fixerades i 45 minuter i 4 % paraformaldehyd (PFA). För gelatinvibratomsnitt placerades vävnadsproverna i inbäddningsformar (Polysciences, T-8), fylldes med varmt gelatin (20 %, löst i 0,1 M fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS)) och postfixerades i 4 % PFA över natten vid 4 °C innan 120-µm sektioner klipptes med hjälp av en vibratom (Leica, VT100S). För färgning av helmonterade hudprover sträcktes hudproverna i 2 timmar i PFA och efterfixerades sedan vid 4 °C i 24 timmar i 20 % dimetylsulfoxid och 80 % metanol. Efter skärning eller postfixering tvättades vävnadsproverna tre gånger i PBS (0,1 M) och inkuberades i 72 timmar vid 4 °C i blockeringslösning och primära antikroppar. Proverna tvättades sedan tre gånger i PBS före 24 timmars inkubation (4 °C) med sekundära antikroppar utspädda i blockeringslösning. Vävnaden tvättades sedan återigen tre gånger och behandlades för vävnadsklarering med hjälp av 2,2′-jodietanol (TDE, Sigma-Aldrich). Sektionerna placerades i ökande koncentrationer av TDE varannan timme, från 10 % till 25 %, 50 % och 97 %, varvid proverna förvarades och monterades på objektglas och täckglas.

Polyklonala antikroppar som är riktade mot Ush2A genererades på kanin av Eurogentec. Fyra antikroppar skapades som binder till olika bindningsepitoper på N- och C-terminalen av Ush2A (N-terminus: antikropp 1, CSPLYNDKPFRSGDNV och antikropp 2, C+SWEKPAENFTRGEII; C-terminus: antikropp 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR och antikropp 2, CIRERPPLVPLQKRMT), och renades från antiserum före användning. Alla fyra antikropparna användes tillsammans (1:200) för färgningsprotokoll i sekventiella färgningar med kyckling anti-NF200 (Millipore, 1:1 000), kanin anti-S100 (Dako, 1:1 000) eller marsvin anti-CK20 (Origene Tech, 1:200). Sekundära antikroppar som användes var anti-kanin Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1:800), anti-höns Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800), anti-mus Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), anti-kanin Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800) och anti-meersvin Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). Til-ed z-stack-bilder togs med hjälp av ett konfokalmikroskop (Carl-Zeiss, katalognummer LSM700) med Zen2009-programvaran. NF200+ och S100+ nervfiber-innerverande Meissners korpuskel och hårsäckar visualiserades och räknades med hjälp av Fiji/ImageJ. För elektronmikroskopiska bilder av ischiasnerven perfunderades djuren och ischiasnerven dissekerades och fixerades i 4 % PFA och 2,5 % glutaraldehyd och kontrasterades med osmiumtetroxid innan den bäddades in i Technovit 7100-harts (Heraeus Kulzer). Ultratunna snitt togs vid 5 600× förstoring. Myeliniserade nervfibrer och icke-myeliniserade fibrer räknades och mättes med hjälp av programvaran Fiji/ImageJ.

Reproducerbarhet

Alla immunohistokemiska experiment och bilder som togs upprepades i flera kohorter av möss på olika dagar, och inga bilder togs från enskilda individer som inte kunde reproduceras. Elektronmikroskopiska bilder togs från olika kullsyskon i en enda experimentkörning.

Mus hudnervpreparat och sensoriska afferenta inspelningar

Kutana sensoriska fiberinspelningar utfördes med hjälp av ex vivo hudnervpreparatet. Möss avlivades genom CO2-inhalation i 2-4 minuter följt av cervikal dislokation. Tre olika preparat utfördes i separata experiment med olika tassregioner: Nervus saphenus som innerverar den håriga huden på bakfoten21, nervus tibialis som innerverar den kala huden på bakfoten samt nervus medialis och nervus ulnaris som innerverar den kala huden på framfoten20. I alla preparat rakades den håriga huden på extremiteten och huden och nerverna dissekerades loss och överfördes till inspelningskammaren, där muskel-, ben- och senvävnad avlägsnades från huden för att förbättra inspelningskvaliteten. Registreringskammaren genomsyrades med en 32 °C syntetisk interstitiell vätska: 123 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO4, 1,7 mM NaH2PO4, 2,0 mM CaCl2, 9,5 mM natriumglukonat, 5,5 mM glukos, 7,5 mM sackaros och 10 mM 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazin-etansulfonsyra (Hepes), pH 7,4. Huden spändes ut och sträcktes så att hudens utsida kunde stimuleras med hjälp av stimulatorsonder. Den perifera nerven fördes genom en intilliggande kammare i mineralolja, där fina filament drogs ut från nerven och placerades på en inspelningselektrod av silvertråd.

De receptiva fälten för enskilda mekanoreceptorer identifierades genom att mekaniskt sondera hudens yta med en trubbig glasstav eller en trubbig pincett. Analog utgång från en Neurolog-förstärkare filtrerades och digitaliserades med hjälp av Powerlab 4/30-systemet och programvaran Labchart 7.1 (ADinstruments). Spike-histogramutvidgning för Labchart 7.1 användes för att sortera spikar från enskilda enheter. Elektriska stimuli (1 Hz, fyrkantiga pulser på 50-500 ms) levererades till receptiva fält för enskilda enheter för att mäta ledningshastigheten och möjliggöra klassificering som C-fibrer (hastighet <1,2 m s-1), Aδ-fibrer (1,2-10 m s-1) eller Aβ-fibrer (>10 m s-1). Mekanisk stimulering av neuronernas mottagningsfält utfördes med hjälp av en piezoaktuator (Physik Instrumente, katalognummer P-841.60) och en Nanomotor med dubbla ändar (Kleindiek Nanotechnik, katalognummer MM-NM3108) som var ansluten till en kraftmätningsanordning (Kleindiek Nanotechnik, katalognummer PL-FMS-LS). Kalibrerade kraftmätningar förvärvades samtidigt med hjälp av Powerlab-systemet och Labchart-programvaran under experimentet (Extended Data Fig. 10).

Då olika fibertyper har olika stimulus-avstämningsegenskaper användes olika protokoll för mekanisk stimulering baserat på enhetstypen. Aβ-fibrer med låg tröskel (RAMs och SAMs) och D-hår av Aδ-fibrer stimulerades med piezoaktuatorn med tre vibrationsstimuli (5 Hz, 25 Hz och 50 Hz, distorsioner som infördes av kraftsensorn i serien uteslöt användning av frekvenser >50 Hz) med ökande amplitud över sex steg (topp-till-topp-amplituder på ~6-65 mN; 20 cykler per steg), och en dynamisk stimulussekvens med fyra ramp-and-hold-vågformer med varierande avböjningshastigheter för sonden (3 s varaktighet; 0.075, 0,15, 0,45 och 1,5 mm s-1; genomsnittlig amplitud 100 mN). Aβ-fiber SAMs och RAMs klassificerades genom närvaro eller avsaknad av eldning under den statiska fasen av ett ramp-and-hold-stimulans respektive, enligt tidigare beskrivning20,21. Enskilda enheter stimulerades dessutom med en serie av fem statiska mekaniska stimuli med ramp-och-håll-vågformer med ökande amplitud (3 s varaktighet; varierande från ~10 mN till 260 mN). SAMs med låg tröskel, Aδ-fibrer med hög tröskel och C-fibrer stimulerades också med hjälp av nanomotorn med fem ramp-and-hold-stimuli med ökande amplituder20.

Enskilda enhetsregistreringar från Pacinianska afferenter

För att bedöma mekanosensitiviteten hos Pacinian corpuscles som är belägna runt fibulan avlägsnades huden och alla muskler från underbenet och den interosseösa nerverna dissekerades fritt från det interosseösa membranet. Därefter avlägsnades fibula och tibia, som hos möss är sammanfogade längs den distala halvan, från djuret tillsammans med den interosseösa nerven och överfördes till en anpassad organbadkammare där de monterades med hjälp av en anpassad mini-vice. Hela dissektionsförfarandet utfördes i iskall dissektionsbuffert som innehöll 108 mM N-metyl-d-glukamin, 20 mM Hepes, 3,5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM natriumglukonat, 5,5 mM glukos, 18,5 mM sackaros och 0,5 mM CaCl2 (justerat till pH 7,4 med NaOH). Efter en återhämtningsperiod på 10 minuter perfuserades preparatet med syresatt inspelningsbuffert (35 °C) som bestod av 108 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,5 mM KCl, 0,5 mM KCl, 0,5 mM KCl, 0,5 mM KCl och 0,5 mM KCl.7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM natriumglukonat, 5,5 mM glukos, 7,5 mM sackaros och 1,5 mM CaCl2 (justerat till pH 7,4 med NaOH), och den proximala änden av den interosseösa nerverna överfördes till en oljefylld inspelningskammare genom att den drogs genom ett litet hål (~1 mm i diameter) som förband organbadkammaren med den intilliggande inspelningskammaren. Efter avlägsnande av perineurium dissekerades enskilda filament fritt och fästes vid inspelningselektroden för registrering av aktionspotential. Registreringarna gjordes med Neurolog-systemet (Digitimer Ltd, katalognummer NL100AK och NL104A) och en PowerLab 4SP som styrdes av LabChart 7.1 (AD Instruments). För att bestämma den mekaniska aktiveringströskeln och frekvensinställningen av pacinianska afferenter tillämpades en serie sinusformade mekaniska stimuli (varaktighet 1 s; linjärt ökande amplitud damp/dt = 30 µm s-1; maximal amplitud 30 µm) med ökande frekvenser (40-480 Hz) på fibulans distala ände med en metallstång (spetsdiameter 1 mm) som var fäst vid en piezoaktuator (Physik Instrumente GmbH, katalognr. P-840.2).

Lärningsuppgift för vibrationsuppfattning hos möss

För det första, för implantation av huvudstödet, sövdes möss med isofluran (1,5-2 % i O2) och injicerades subkutant med metamizol (200 mg per kg kroppsvikt). Ett stöd av lättmetall implanterades på skallen med lim (UHU dent) och tandcement (Paladur). Musens temperatur övervakades med en rektal sond och hölls på 37 °C med hjälp av en värmekudde. Mössen placerades sedan i sin hembur med metamizol (200 mg ml-1) i dricksvattnet. Implanterade möss vantogs vid huvudstöd 3-5 dagar efter operationen. Mössen vantogs gradvis i beteendeuppställningen till huvudfixering. Därefter, 1 d efter det att vattenrestriktionen började, genomgick mössen två parningssessioner på på varandra följande dagar.

Under parningssessionerna (30-45 minuters varaktighet) gavs vattenbelöningar från en vattenspruta parat med presentation av vibrationsstimulans (3 s varaktighet, 5 Hz, 60 mN) på den kala huden på framtassan för att bygga upp en association mellan stimulus och belöning. Vibrationsstimulansen gavs till tassen via en skräddarsydd, dämpad glasstav på 2 mm2 som var fäst vid en piezoaktuator (PICMA från Physik Instrumente, katalognummer PL127.11). Ett spännings-kraftförhållande kalibrerades med hjälp av ett kraftmätningssystem (Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific) för att mäta den applicerade sinusformiga kraftprofilen som applicerades av piezoanordningen efter varje experiment. Den böjande piezoaktuator som användes kan ha tillfört en del harmoniskt brus jämfört med andra staplade piezosystem. Kalibrering av piezoen i varje experiment säkerställde dock att de betydande underskotten i taktil uppfattning hos Ush2a-deficienta möss sannolikt inte var en teknisk artefakt.

Efter parning påbörjades dagliga träningssessioner under vilka mössen fick en liten vattenbelöning (4-7 μl) från munstycket när de slickade korrekt under ett möjlighetsfönster vid stimulusets början (3,5 s). Fångstförsök, där inget stimulus presenterades och slickningar räknades som falsklarm, var interfolierade som 50 % av de totala försöken. Försöken var inte kopplade till någon extern händelse eller stimulus enligt tidigare beskrivning10 och levererades med slumpmässiga tidsintervall mellan 3 och 30 s. Om mössen slickade under ett fönster på 2 s före stimulusets start, infördes en fördröjning på 3 till 30 s för att främja associeringen mellan stimulus och vattenbelöning. Ett träningspass bestod av cirka 60 försök (30× stimulus + 30× fångst). Träff- och falska larmfrekvenser jämfördes för att bedöma prestationen under träningstillfällena. För att testa att mössen slickade som svar på vibrationsstimulansen på framtassan inkluderades en session i slutet av träningen där den stimulerande anordningen flyttades 3-5 mm under tassen, så att ingen hudkontakt skedde. Under efterföljande försöksdagar efter att mössen framgångsrikt hade lärt sig uppgiften gavs vibrationsstimuli med olika amplituder och frekvenser. För vibrationer på 5 Hz användes krafter på 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN och 6 mN för att stimulera framtanden, med två olika amplituder som varvades med fångstförsök under varje dag. Exempelvis varvades 48-mN- och 24-mN-stimuli och fångstförsök under en session, som bestod av cirka 100 försök (33× 48-mN-stimuli + 33× 24-mN-stimuli + 34× fångstförsök). 6-mN-stimuli testades under två sessioner. För 25-Hz- och 125-Hz-vibrationer varvades 60-mN- och 12-mN-krafter med samma frekvens med fångstförsök på samma sätt under två testtillfällen.

Beteendeförsök med parade impulshämning hos möss

Musens startreaktion bedömdes med hjälp av Startle Response-systemet (SR-LAB, San Diego Instruments). Möss vantogs vid apparaten i 30 minuter varje dag under 3 d före testningen. I korthet mättes musens startreaktioner under totalt 48 försök med ensam puls45 (40 ms varaktighet, 129 dB) och försök med prepuls + puls (20 ms prepuls på 69, 73 eller 81 dB). Försöken med förimpulser var 200 ms före pulsförsöken. Den procentuella parade pulsinhiberingen (% PPI) för varje prepulsintensitet beräknades som %PPI = 100 × ((enbart puls) – (prepuls + puls))/ enbart puls.

Mus vFh- och brushbeteendestudier

Möss vantrivdes vid testmiljön i 30 minuter varje dag under 3 d före testningen. Under försöksdagarna placerades mössen i enskilda plexiglaskuber på en förhöjd nätplattform. För penseltestet ströks den vänstra bakfoten från häl till tå med en färgpensel med 2 mm huvud 10× med slumpmässiga intervaller. Procentandelen utdragningar beräknades. Under efterföljande testdagar mättes mekaniska nocifensiva tröskelvärden för tillbakadragande med hjälp av vFhs. Kortfattat stimulerades vänster bakfots plantarytor med vFh-filament och reflextröskeln bestämdes med hjälp av upp-och-ned-metoden46. Beroende på djurets reaktion applicerades vFhs med högre eller lägre kraft på bakfoten för att skapa en serie av sex till nio positiva eller negativa reflexuttag. Detta svarsmönster konverterades sedan så att data uttrycks som logaritmen av medelvärdet för tröskelvärdet för 50 % reflexuttag46.

Dataanalys av psykofysiska data från människor

Data testades med avseende på normalitet, och skillnader i psykofysisk prestanda för varje test mellan kontrolldeltagare och patienter med Ushers syndrom jämfördes med hjälp av oparade Student’s t-test eller Mann-Whitney U-test. Z-transformationer användes för att jämföra enskilda individuella dataprofiler med medelvärdet och s.d. för den friska kontrollen. Z-poängen beräknades med hjälp av Excel-kalkylblad baserat på formeln z = (patientpoäng – gruppmedelvärde per s.d. av gruppmedelvärdet). Z-värden >0 indikerar funktionsvinst, vilket innebär att deltagaren är mer känslig för de testade stimuli jämfört med friska kontroller. Enskilda z-värden som ligger utanför 95 % konfidensintervallet (dvs. z-värde <1,96 eller >1,96 s.d.) för datasetet för friska kontroller kan identifieras. Prestanda i varje test testades i parvisa jämförelser med Mann-Whitney U-testet och vi ansåg att P < 0,01 var statistiskt signifikant.

Dataanalys av musens vibrationsbeteende

Stick registrerades med en sensor vid spetsen av vattenbelöningens pipa. Vid stimulusförsök räknades en träff när det fanns ett slick inom möjlighetsfönstret (3,5 s) efter stimulusets början. Beteendedata samlades in med hjälp av anpassade rutiner i Lab View med en samplingsfrekvens på 1 kHz, och anpassade Python-skript användes för analys. Under fångstförsök skedde ett falsklarm när det förekom en slickning under ett lika långt möjlighetsfönster. För att bedöma om mössen lyckades lära sig detektionsuppgiften jämfördes träfffrekvensen med falsklarmfrekvensen inom samma träningssession, med hjälp av tvåvägs variansanalys med upprepade åtgärder (ANOVA) med Bonferronis post-hoc-testning.

För att kvantifiera prestationen i detektionsuppgifterna använde vi d’ (sensitivitetsindex) i stället för procentandelen korrekta försök för att ta hänsyn till bias i slickkriterierna47. För att beräkna d’ användes följande formel: d’ = z(h) – z(fa), där z(h) och z(fa) är den normala inversen av den kumulativa fördelningsfunktionen för träff- respektive falsklarmprocenten. För att undvika oändliga d’-värden, när alla försök rapporterades (frekvens = 1) eller inget försök rapporterades (frekvens = 0), ersattes frekvenserna med (1½N) respektive (½ N), där N är antalet försök i vilka stimulus presenterades48. Z-värdena för träffsäkerhet och falska larm beräknades med hjälp av OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) med funktionen NORMINV. Vi har utfört statistiska tester på data endast där minst en av genotyperna visar d’ > 1,0, vilket indikerar att dessa möss rapporterade stimulus. Beteendedata samlades in med hjälp av anpassade rutiner i Lab View med en samplingsfrekvens på 1 kHz, och anpassade Python-skript användes för analys. De anpassade koderna och skripten är tillgängliga på begäran; mer information finns i Nature Research Reporting Summary som är kopplad till detta manuskript.

Slickbeteenden beräknades och plottades som slicksannolikhet, första slickfrekvens (Hz) eller genomsnittlig första slicklatens (s). Dessa mått beräknades på följande sätt: Slickarsannolikhet är sannolikheten att en mus slickar minst en gång under möjlighetsfönstret i ett stimulus- eller fångstförsök (försök med minst 1 slick/totala försök). I PSTH:erna för första slickandet visar vi den indelade fördelningen av latenserna för första slickandet i stimulus- eller fångstförsöken. För att normalisera dessa data mellan olika möss dividerade vi antalet första slickningar med det totala antalet försök. Genom att dividera värdet för första slickandet med binbredden beräknade vi värdet i hertz (slickanden per s). Den genomsnittliga latensen för första slickningen (s) beräknades genom att addera latenserna för första slickningen i varje träffförsök och dividera med det totala antalet försök.

Dataanalys av inspelningar av hudnervpreparat

Kutana enheter för fram- och bakhand kategoriserades baserat på deras ledningshastighet och svar på mekaniska stimuli. Mekaniska trösklar för enheterna beräknades som den temperatur eller mekaniska amplitud som krävs för att framkalla den första aktionspotentialen. Alla statistiska analyser utfördes med GraphPad Prism 6.0 och Python. De statistiska testerna omfattar tvåvägs ANOVA för upprepade åtgärder med Bonferronis post-hoc-test, Students t-test, Mann-Whitney U-test och Wilcoxons matchade partest. Kolmogorov-Smirnov-test användes för att bedöma uppgifternas normalitet. Asterisker i figurerna anger statistisk signifikans: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Dataanalys av elektronmikroskopi av musnerver

För analys av elektronmikroskopiska bilder av ischiasnerven hos musen räknades antalet myelinerade och icke-myelinerade fibrer i 12 sektioner per nerv. Det totala antalet fibrer per nerv extrapolerades sedan från tvärsnittsytan för varje nerv.

Rapporteringssammanfattning

Fördjupad information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till denna artikel.