15 februari 2010 (Vol. 30, No. 4)

Scott B. Mohler

Enkla steg för framgångsrik bioluminescensbildtagning av djur

Luciferin är det grundläggande substratet för bioluminescensanalyser. Bioluminiscens bygger på en enkel reaktion där ATP ger bränsle till luciferaskatalys av luciferin från eldflugor (skalbaggar) för att producera ljus, och bioluminiscens har breda användningsområden. Användningen som indikator för biomassa gör det möjligt att upptäcka mikroorganismer i konsumentprodukter, på ytor i tillverkningsanläggningar och har till och med använts för att avgöra om det finns liv på månen och Mars.

Bioluminescens används för in vitro- och in vivo-övervakning av biologiska processer, inklusive genuttryck och protein-proteininteraktioner. Luciferin används till exempel i reportergenanalyser för att studera geners reglering och funktion, där uttrycket av den luciferinmärkta reportern är en markör för att indikera ett lyckat upptag av den aktuella genen i rekombinanta DNA-tekniker. Som detektionsreagens används luciferin-luciferasreaktionen vid pyrosekvensering för att åstadkomma snabb detektion av baser i dagens DNA-sekvenseringssystem med hög genomströmning.

På senare tid har bioluminescensavbildning framträtt som en kraftfull teknik för direktstudier av olika cellpopulationer i levande smådjur, t.ex. möss. I denna teknik är celler (t.ex. cancerceller, stamceller, T-celler) utformade för att uttrycka luciferas och lysa. Icke-invasiv visualisering i levande djur med hjälp av en känslig laddningskopplingskamera gör det således möjligt att i realtid observera sjukdomsutveckling och regression vid olika tidpunkter under den terapeutiska behandlingen. Denna teknik används för att förstå den molekylära grunden för patologier som neurodegenerativa sjukdomar, kardiovaskulära sjukdomar, fetma och cancer och är av enormt värde för klinisk, diagnostisk och läkemedelsutveckling.

Vetenskapsmän vid Regis Technologies har identifierat vanliga svagheter i luciferaseanalyser. Problemen uppstår ofta innan testet påbörjas. Firefly luciferin är en känslig molekyl, och även välplanerade experiment kan ge felaktiga resultat om luciferin hanteras felaktigt och skadas före användning. I den här artikeln beskriver vi optimalt salt, renhet, hantering och förvaring av luciferin för att säkerställa framgångsrika och konsekventa resultat vid bildbehandling av djur och andra analyser.

Köpöverväganden

Forskare frågar sig ofta vilken form av luciferin de ska använda. Kalium- och natriumsalter av luciferin brukar användas omväxlande. Molekylens upplösning är dock en viktig faktor att ta hänsyn till för vissa analyser. Natriumsaltet är mer lösligt i vatten (>100 mg/mL) än kaliumsaltet (55 mg/mL). Den fria syraformen, även om den fortfarande finns tillgänglig, används inte ofta på grund av dess svårighet att lösas upp.

Om några få föroreningar kan påverka experimenten på olika sätt kan reagensets ursprungliga renhet vara ett viktigt övervägande.

L-luciferin, en enantiomer av D-luciferin (figur 1), är en känd förorening i syntetiskt luciferin. Det har visats att den fungerar i luciferasreaktioner, men det är troligt att en betydande förskjutning av den högsta ljusemissionen kommer att inträffa beroende på vilka datainsamlingsparametrar som används. L-luciferin är lätt att detektera och kvantifiera med chiral HPLC och bör anges i tillverkarens analysintyg. Det mesta luciferin bör innehålla mindre än 0,5 % L-luciferin, även om högre gränser sannolikt kan tolereras så länge L-luciferinnivåerna förblir konstanta under hela försöket.

Dehydroluciferin (figur 1) är en förorening som fungerar som en hämmare av luciferas, vilket undertrycker blixthöjden och den totala integrationen. Ett prov dopat med 1 % dehydroluciferin uppvisar mindre än halva flashhöjden och mindre än 25 % av den totala integrationen under 15 minuter. Dehydroluciferin kan bildas under syntesen eller lagringen av luciferin. Att välja en tillverkare som levererar låga nivåer av dehydroluciferin bidrar till att säkerställa tillförlitliga och repeterbara resultat.

Många vanliga spårföroreningar från syntesen av luciferin kan hämma andra enzymer i komplexa system och kan orsaka experimentell variabilitet på grund av skillnader från parti till parti eller från tillverkare till tillverkare.

Figur 1. Strukturell jämförelse av D-luciferin och föroreningar

Lagring

Firefly luciferin är känsligt för ljus, syre och fukt och måste skyddas. Ljus och syre kan katalysera oxidationen av luciferin till dehydroluciferin. Om luciferin lämnas i en bärnstensflaska under kväve i rumstemperatur börjar luciferin sönderdelas till dehydroluciferin efter en månad (figur 2), men är stabilt i en oöppnad flaska i minst två år i en frysbox. Upplöst i vatten med tillräckligt med syre omvandlas luciferin till dehydroluciferin på bara några dagar.

Luciferin bör köpas och förvaras i så liten mängd som möjligt för att förhindra nedbrytning till dehydroluciferin vid upprepade cykler av frysning, upptining och öppning. Om luciferinreagenset köps in i bulk, kan det bidra till stabiliteten genom att dela upp det i bärnstensfärgade flaskor för engångsbruk. Långtidsförvaring som fryst lösning rekommenderas inte för känsliga tillämpningar, t.ex. studier av hela djur. För att bidra till att bromsa nedbrytningen i frysta lösningar, spola lösningen med kväve eller argon före frysning.

Figur 2. Luciferin nedbrytning till dehydroluciferin mot tiden vid 25ºC och -20ºC

Hantering

När luciferinflaskan öppnas måste den få komma helt upp i rumstemperatur och sedan spolas med kväve eller argon innan den försluts på nytt. Om luciferinlösningarna ska användas inom några timmar behövs få försiktighetsåtgärder. Lösningar som kommer att användas under en dag bör spolas med kväve eller argon. Lösningar bör inte användas under flera dagar, eftersom dehydroluciferinbildning kommer att ske.

Scott B. Mohler ([email protected]) är produktchef på Regis Technologies. Webbplats: www.registech.com.