FALLREDOVISNING

En 5-årig pojke diagnostiserades med akut lymfatisk leukemi i december 1994 och inkluderades i Fralle 93-protokollet. Barnet uppnådde hematologisk remission 6 veckor efter att induktionskemoterapi påbörjades. Han togs emot som öppenvårdspatient och svarade väl på behandlingen under de följande åren. Vid en konsultation i mars 1997 fick patienten dock en feberepisod när han genomblöddes med Port-a-cath-systemet. Den kliniska undersökningen visade ingen septisk lokalisering. Leukocytantalet var 10 860/ml, med ett absolut neutrofilantal på 8 850/ml. En uppsättning blododlingar samlades in från Port-a-cath-systemet, och den aeroba flaskodlingen gav gulpigmenterade kolonier av grampositiva coryneformstänger. Pojken fick ceftriaxon (1 g) intravenöst en gång, följt av cefadroxil 500 mg två gånger om dagen i 7 dagar. På grund av en ihållande feber gavs cefadroxil i ytterligare en vecka och immunsuppressiva läkemedel avbröts under samma period. Patientens anamnes var oemotsäglig under de följande två månaderna, och ingen blododling utfördes när han kom på sina månatliga besök. I juni 1997 presenterades barnet för konsultation som subfebril och klagade över trötthet. En fysisk undersökning visade inget infektionsfokus, och leukocytantalet var inte förhöjt. En uppsättning blododlingar togs från Port-a-cath, och den aeroba flaskan visade samma grampositiva coryneformiga stavar, som senare identifierades som Microbacterium sp. Kateterrelaterad bakteriemi diagnostiserades, och den centrala venösa katetern avlägsnades. Ampicillin (100 mg/kg/dag) gavs intravenöst perioperativt och den första dosen gavs 24 timmar före operationen. Patientens kliniska tillstånd förbättrades snabbt efteråt. Port-a-katet odlades på Columbia blodagar. Inom 24 timmar vid 37 °C hade en renkultur av gulpigmenterade kolonier av en icke-fermentativ, grampositiv, något missfärgad stav vuxit fram. Tyvärr gick subkulturer förlorade och ingen ytterligare undersökning kunde utföras.

Den stam som isolerades från patientens blodkulturer, märkt CF36, var en gulpigmenterad, rörlig coryneform med en oxidativ metabolism, proteolytisk aktivitet och cellulära fettsyror av förgrenad typ. Dessa allmänna kännetecken tyder på släktet Microbacterium, som omfattar både fermentativa och oxidativa arter, de senare tidigare kallade Aureobacterium (13).

Den 16S rRNA-genen (rDNA) sekvensen undersöktes genom att använda en uppsättning primers för amplifiering. PCR-produkterna renades från agarosgel med ett QIAquick gelextraktionskit (Qiagen, Westburg, Nederländerna). Sekvensanalysen utfördes med en 3100 automatisk DNA-sequencer (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien) med hjälp av ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit. Varje sekvens jämfördes med sekvensdata som finns i databaser med hjälp av BLAST (10). Ett fylogenetiskt träd konstruerades med hjälp av grannföreningsmetoden (8, 11).

16S rDNA-sekvensering baserad på 1490 nukleotider av stam CF36 avslöjade de högsta likhetsnivåerna på 99,5 % med sekvensen av M. luteolum DSM 20143T och 99,3 % med sekvensen av M. oxydans DSM 20578T. Den var också nära besläktad med sekvenserna av M. saperdae (99,2 %) och M. liquefaciens (99,1 %) (Tabell (Tabell1).1). Fyra andra liknande stammar samlades in från olika prover från andra patienter som märktes CF7 isolerad från en blododling, CF34 från ett bronkialaspirat, CF130 från en blododling och CF40 från en okänd mänsklig källa. Ytterligare en stam, CF128, erhölls från ett grönsaksprov. De fem stammarna uppvisade 16S rDNA-sekvenser som liknade 16S rDNA-sekvenser från typstammen av M. oxydans, med en likhet på mellan 99,3 och 99,4 %, medan deras likhet med CF36 var mellan 99,9 och 100 %. Nio andra kliniska isolat uppvisade 99,9-100 % likhet med typstammen av M. oxydans.

Dessa resultat föranledde oss att utföra en omfattande studie av följande sex stammar: CF36, CF7, CF34, CF40, CF128 och CF130.

Cellulära fettsyror, bestämda enligt tidigare beskrivning (14), visade samma profil i alla stammar. De genomsnittliga procentandelarna av de viktigaste cellulära fettsyrorna var följande: 40,3 % anteiso-C15:0 (intervall, 37,1 till 46,0 %), 27 % anteiso-C17:0 (intervall, 22,9 till 31,3 %), 15,7 % iso-C16:0 (intervall, 13,8 till 19,3 %), 9,3 % iso-C15:0 (intervall, 4,6 till 13,9 %) och 4,2 % iso-C17:0 (intervall, 3,0 till 7,2 %).

Analys av CF36- och CF7-cellväggspeptidoglykan utfördes vid Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Tyskland) av N. Weiss med en tunnskiktskromatografimetod enligt Schleifer och Kandler (12). Peptidoglykanen var av typen B2β med d-ornitin som diaminosyra.

DNA-DNA-hybridisering utfördes av P. Schumann vid DSMZ enligt beskrivning av De Ley et al. (3) med modifieringar av Escara och Hutton (4) och Huss et al. (7). DNA-homologin för CF36 med M. luteolum LMG 16207T var endast 33,7 % och den med M. oxydans DSM 20578T var 46,6 %, men höga nivåer av DNA-släktskap på 78,1, 81,8 och 78,2 % erhölls med stammarna CF7, CF34 respektive CF40. Detta stämde överens med att de skulle hänföras till en enda art. G+C-innehållet i DNA från stam CF36 var 69,9 mol% enligt bestämning vid DSMZ.

De sex stammarna var grampositiva, rörliga, coryneformiga stavar. De växte bra på Columbia blodagar vid 37°C och färgen på kolonierna var gul. Stammarna var strikt aeroba, katalaspositiva och oxidasnegativa. De kunde hydrolysera esculin och gelatin. Även om 16S rDNA-sekvensering visade nära släktskap med M. luteolum, M. saperdae och M. liquefaciens var dessa arter fenotypiskt helt olika. Ingen av dem växte vid 37 °C, M. luteolum och M. liquefaciens var omotila och M. luteolum och M. saperdae var icke proteolytiska. Dessa resultat stämmer överens med uppgifter i litteraturen (2). Stammarnas fenotypiska egenskaper liknade mest M. oxydans. Glukos syrades oxidativt på fenolröd agar med låg peptonhalt och fenolröd agar (15). Alla stammarna växte vid 40 °C, medan inget av M. oxydans-isolat kunde växa vid denna temperatur. Dessutom syrades inte salicin, till skillnad från M. oxydans. De nya stammarna kunde också särskiljas från M. oxydans med hjälp av API 50CH-assimilationsremsor (bioMérieux). Laktos utnyttjades och 2-ketoglukonat utnyttjades inte, medan M. oxydans hade motsatta reaktioner. När API ZYM-strips (bioMérieux) användes skiljde negativa reaktioner för esteraslipas (C8), α-chymotrypsin och β-glukosidas de sex stammarna från M. oxydans. Fenotypiska egenskaper som skiljer de nya stammarna från besläktade oxiderande, rörliga, proteolytiska Microbacterium-arter som växer vid 37°C redovisas i tabell Tabell22.

Antibiotikakänslighet testades på Mueller-Hinton-agar med E-testremsor (PDM, Solna, Sverige). MIC-områdena (mikrogram per milliliter) var följande: penicillin, 1,5 till 2; ampicillin, 1 till 1,5; cefotaxim, 3 till 6; cefalothin, 16 till 24; ciprofloxacin, 1 till 1,5; gentamicin, 2 till 3; vankomycin, 3 till 4; klaritromycin, <0,016.

Fenotypiska, kemotaxonomiska och genetiska studier tyder på att de sex undersökta stammarna tillhör släktet Microbacterium men utgör en ny art, för vilken namnet Microbacterium paraoxydans föreslås och som är nära besläktad med M. oxydans, M. saperdae, M. luteolum och M. liquefaciens (Fig. (Fig.11).

Bara få rapporter behandlar isolering av Microbacterium-arter från kliniskt material. De flesta av dem hänfördes ursprungligen till CDC-grupp A-4 eller A-5, och även nyare isolat identifierades sällan på artnivå (1, 5, 6, 9). Endast i ett fåtal fall visade sig isolatet vara det orsakande agenset för infektionen. Ett fall av endoftalmit orsakad av ett Microbacterium rapporterades av Funke et al. och på grundval av 16S rDNA-sekvensering ansågs stammen tillhöra en obeskriven art (6). I en studie av Microbacterium spp. som påträffades i kliniska prover identifierades flera stammar som M. arborescens och M. imperiale, men ingen genetisk bekräftelse utfördes (5). Ett nosokomiskt utbrott av Microbacterium-relaterad bakteriemi rapporterades hos cancerpatienter, men den orsakande organismen identifierades inte till artnivå. En central venkateter var den viktigaste riskfaktorn i den studien (1). Nyligen rapporterades två fall av kateterrelaterad Microbacterium-bakteriemi, som identifierades genom 16S rDNA-sekvensering. Det ena isolatet var till 99,4 % besläktat med M. oxydans och det andra var till 98,7 % besläktat med M. trichothecenolyticum, men en formell identifiering på artnivå uppnåddes inte (9).

Stam CF36 isolerades från patientens blododlingar med flera veckors mellanrum, och även om den organism som isolerats från den borttagna katetern endast delvis kunde identifieras, är det troligt att den upprepade bakterieminskningen var katetarrelaterad, vilket bekräftar att intravaskulära katetrar utgör en riskfaktor för infektion med dessa organismer. Deras ursprung kan vara patientens hud, men eftersom mikrobakteriernas naturliga livsmiljö är den livlösa miljön kan det inte uteslutas att kontaminerad perfusionsvätska fröade patientens kateter.

Under de senaste decennierna har vi samlat in 30 Microbacterium-isolat av mänskligt ursprung vid vårt laboratorium. Alla dessa stammar identifierades genom en uppsättning fenotypiska och kemotaxonomiska egenskaper och genom 16S rDNA-sekvensering. M. oxydans var den överlägset mest frekvent isolerade arten och stod för ungefär en tredjedel av stammarna (9 av 30), följt av M. paraoxydans (5 stammar); M. aurum och M. lacticum representerades av 4 stammar vardera. De återstående åtta stammarna var spridda över flera arter, med ett M. foliorum-isolat, ett M. schleiferi-isolat, ett M. testaceum-isolat och fem isolat som inte passade in på någon beskriven art.

Och även om mikrobakterier sällan är inblandade i sjukdomar hos människor ökar antalet relevanta isolat som hittas i nosokomiala miljöer. Även om mer än 30 arter har erkänts i släktet är det troligt att endast ett begränsat antal av dem isoleras från kliniska prover. En mer exakt identifiering av isolat från människor kan hjälpa oss att bättre förstå vilka arter som är benägna att bli opportunistiska patogener.