Abstract

Cellulär ämnesomsättning är beroende av lämplig koncentration av intracellulärt oorganiskt fosfat (Pi). Gener som reagerar på Pi-svält tycks vara involverade i flera metaboliska vägar, vilket innebär ett komplext Pi-regleringssystem i mikroorganismer och växter. En grupp enzymer krävs för absorption och upprätthållande av lämpliga fosfatnivåer, som frigörs från fosfatestrar och -anhydrider. Fosfatassystemet är särskilt lämpligt för att studera regleringsmekanismer eftersom fosfatasaktivitet lätt kan mätas med specifika metoder och skillnaden mellan de undertryckta och avtryckta nivåerna av fosfatasaktivitet lätt kan påvisas. I denna artikel analyseras det proteinfosfatassystem som induceras under fosfathunger i olika organismer.

1. Introduktion

Regulering av cellulära processer, såsom cellulär differentiering, proliferation, celldöd, rörlighet, metabolism, överlevnad och organisering av cytoskelettet, som svar på vissa stimuli är grundläggande för alla aspekter av celllivet . Proteinfosforylering är en av de vanligaste mekanismerna som används för att reglera dessa processer. Processer som styrs reversibelt genom proteinfosforylering kräver både ett proteinkinas och ett proteinfosfatas .

Traditionellt sett har proteinkinaser studerats mer intensivt än proteinfosfataser på grund av den tidigare uppfattningen att proteinkinaser ger en finreglering av proteinfosforylering, medan proteinfosfataser endast verkar för att avlägsna fosfatgrupper. Först under det senaste decenniet insåg man att proteinfosfataser också regleras av en rad olika mekanismer och att de inte är mindre viktiga för cellfysiologin än proteinkinaser . Proteinfosfataser kan hydrolysa fosfomonoestermetaboliter och frigöra oorganiskt fosfat (Pi) från dessa substrat .

Fosfor, i form av oorganiskt fosfat (Pi), är en av de viktigaste makronäringsämnena för alla organismer . Det används inte bara vid biosyntesen av cellkomponenter, såsom ATP, nukleinsyror, fosfolipider och proteiner, utan är också involverat i många metaboliska vägar, inklusive energiöverföring, proteinaktivering och metaboliska processer för kol- och aminosyror . Stora mängder fosfat krävs för cellens överlevnad. I växter är Pi viktigt för tillväxt och utveckling . I svampar reglerar Pi-signaltransduktionsvägen uttrycket av många fosfatresponsiva gener som är involverade i fångavskiljning och Pi-upptag från extracellulära källor . Hos trypanosomatiska parasiter påverkar Pi deras förmåga att korrekt växa och kolonisera ryggradslösa djur.

Sammanfattningsvis är proteinfosfataser och kinaser nödvändiga för Pi-homeostas under förvärv, lagring, frisättning och metabolisk integrering av Pi . Syftet med denna artikel är att sammanfatta regleringen av fosfataser genom oorganiskt fosfat, med tonvikt på dessa enzyms roll i cellbiologin.

2. Återkopplingskontroll av fosfataser genom oorganiskt fosfat: PHO-vägen

Saccharomyces cerevisiae har flera fosfataser med olika specificiteter, cellplacering och permeaser som används vid Pi-upptag. Den uppsättning gener som ansvarar för dessa aktiviteter är koordinerat undertryckt av Pi-koncentrationen i tillväxtmediet . Cellens förvärv, lagring, frisättning och metaboliska integrering av Pi kräver att många viktiga enzymer deltar, t.ex. extracellulära sura fosfataser (APaser), fosfodiesteraser, Pi-transportörer, polyfosfatkinaser, alkaliska fosfataser (ALPaser) och endopolyfosfataser . Aktiviteterna hos dessa enzymer är intimt kopplade till Pi homeostas, och de är föremål för reglering via Pi-signaltransduktionsvägen (PHO) som svar på varierande Pi-nivåer .

I en aktuell modell för PHO-reglering är den positiva regulatorn (eller positiva faktorn) Pho4p, som kodas av PH04-genen, oumbärlig för transkriptionell aktivering av PHO-gener genom sin aktivitet och placering. I medium med hög Pi-halt hämmar ett cyklinberoende kinaskomplex (CDK) bestående av Pho80p och Pho85p Pho4p-funktionen genom hyperfosforylering. Hyperfosforylerat Pho4p stannar kvar i cytoplasman och kan inte aktivera transkriptionen av PHO-generna. När Pi-koncentrationen i mediet är tillräckligt låg hämmar Pho81p funktionen hos Pho80p-Pho85p-komplexet , vilket gör att Pho4p kan förflytta sig till kärnan och aktivera transkriptionen av PHO-generna . Dessa gener kodar för transportörerna Pho84p och Pho89p med hög affinitet, de utsöndrade sura fosfataserna Pho5p, Pho11p och Pho12p samt andra besläktade proteiner som ökar återvinningen av Pi från extracellulära källor.

Denna PHO-väg har beskrivits i olika organismer, t.ex. växter, bakterier och svampar.

3. Fosfatassystemet i jäst

Inledningsvis observerades att flera fosfatasgener moduleras av Pi-koncentrationen i odlingsmediet; PHO-vägen karakteriserades således ursprungligen av differentiellt uttryckta fosfataser .

I S. cerevisiae är transkriptionen av gener som kodar för sura och alkaliska fosfataser och Pi-transportern koordinerat undertryckt och avtryckt beroende på Pi-koncentrationen i odlingsmediet . De flesta av de fosfataser som syntetiseras under Pi-begränsande förhållanden är extracellulärt lokaliserade eller är associerade med plasmamembranet eller cellväggen.

De Pi-reglerade fosfatasgenerna omfattar PHO5 , som kodar för huvuddelen av de repressibla sura fosfataserna (rAPase; optimalt pH 3-4; EC 3.1.3.2), och dess isozymer PHO10 och PHO11 . Dessa tre rAPaser är glykoproteiner som finns i cellväggen eller i det periplasmatiska utrymmet. De är ansvariga för fosfatfångst och arbetar tillsammans med transportörer med hög affinitet för att få tag på fosfat när Pi-koncentrationen i miljön är låg . Det rAPas som kodas av PHO5-genen glykosyleras under sekretionen över membranet och lokaliseras i det periplasmatiska utrymmet . Pho5p är ansvarig för >90% av APase-aktiviteten .

Eftersom PHO5-genprodukten utgör huvuddelen av de sura fosfataserna är regleringen av PHO5 avgörande för den cellulära fosfathomeostasen. Transkriptionsaktivatorer, Pho4p och Pho2p, krävs för att generera den aktiva kromatinstrukturen i PHO5-promotorn och stimulera transkriptionen. Pho80p-Pho85p är ett cyklin/cyklinberoende kinaskomplex som fosforylerar Pho4p på flera ställen för att negativt reglera Pho4p-funktionen . Huang och O’Shea genomförde en kvantitativ enzymatisk screening med hög genomströmning av en samling deletioner i jäst för att söka efter nya mutanter som är defekta i PHO5-uttrycket. Bland de konstitutiva mutanterna uppvisade stammarna pho80 och pho85 de mest förhöjda nivåerna av Pho5-fosfatasaktivitet och PHO5 mRNA under förhållanden med hög fosfathalt, vilket överensstämmer med deras centrala roll i PHO-vägen. Fullständig förlust av den höga kinasaktiviteten (Pho80p-Pho85) resulterar i full aktivering av transkriptionsfaktorn Pho4, vilket leder till fullt PHO5-uttryck.

En annan viktig klass av fosfataser i S. cerevisiae är de alkaliska fosfataserna (ALPase; optimalt pH 8; EC 3.1.3.1). PHO8 kodar för ett icke-specifikt repressibelt alkaliskt fosfatas (rALPase). Det är ett vakuolokaliserat glykoprotein som klyver olika substrat för att hämta fosfat från intracellulära produkter . Pho8p är ett Mg2+/Zn2+ -beroende dimeriskt protein som liknar ALPas i Escherichia coli och i däggdjursceller . Enzymprodukten från PHO13 är ett monomeriskt protein och är specifik för p-nitrofenylfosfat (pNPP) och histidinylfosfat. Detta enzym aktiverades starkt av Mg2+-joner, med ett pH-optimum på 8,2 och en hög specifik aktivitet för pNPP, med ett medelvärde på 3,6 × 10-5 M .

4. Fosforstress modulerar sura fosfataser i växter

Syra fosfataser (APaser) kan vara aktiva mot ett brett spektrum av organiska fosfater som finns i marken. Dessa enzymer är ospecifika ortofosforiska monoesterfosforhydrolaser (EC 3.1.3.2) som klyver Pi från esterbindningsställen. De utsöndrade växtfosfataserna har en aktivitet på 50 % över ett brett pH-område (4,0-7,6), en aktivitet på 80 % över ett brett temperaturområde (22 °C-48 °C) och är stabila vid så höga temperaturer som 60 °C, vilket gör dem till idealiska kandidater för aktiva markenzymer .

APaser förekommer rikligt i Arabidopsis och representeras av minst fyra genfamiljer. En nyligen genomförd undersökning av det annoterade Arabidopsisgenomet identifierade sekvenser för 1 His APas, 4 fosfatidiska APaser, 10 APaser för vegetativt lagringsprotein och 29 lila APaser .

Under de senaste åren har det funnits ett stort intresse för lila APaser (PAPs). Jämförande analyser av strukturen hos PAPs från högre växter och däggdjur har gjort det möjligt att identifiera bevarade sekvenser och strukturella motiv i denna typ av enzym från många eukaryota arter .

Biokemiskt sett fungerar växt-PAPs som homodimera proteiner med en molekylmassa på ~55 kDa per monomer, medan däggdjurs-PAPs vanligtvis är monomera proteiner med en molekylmassa på ~35 kDa . Många PAP är glykoproteiner som är inriktade på den sekretoriska vägen . En PAP från Spirodela oligorrhiza har visat sig vara glykosylfosfosphatidylinositolförankrad i cellen . Strukturellt sett har växters PAPs två domäner. NH2-domänen har ingen katalytisk funktion. COOH-domänen har metallcentret och är enzymets katalytiska domän. En annan PAP från Lupinus albus kan innehålla en tredje domän, med en struktur som liknar steroldesaturasernas, vid dess karboxylterminus . Det är inte känt hur vanliga de två sistnämnda formerna av posttranslationell modifiering är i PAP från andra arter. PAPs är metalloenzymer som har ett tvåkärnigt metalljonkomplex i sin aktiva plats. Deras karakteristiska rosa till lila färg beror på en laddningsöverföring genom en tyrosinrest som koordinerar en järnjon . Detta enzym kan hydrolysa fosforsyraestrar och -anhydrider .

PAP har isolerats från Phaseolus vulgaris (bönor), Glycine max (sojabönor), Lupinus albus (vita lupiner), Lycopersicon esculentum (tomater), Triticum aestivum (vete), Hordeum vulgare (korn), Zea majs (majs) och Oryza sativa (ris).

Plantans reaktion på Pi-svält kan delas in i två kategorier: den specifika reaktionen och den allmänna reaktionen. De specifika svaren främjar effektiv mobilisering och förvärv av Pi från tillväxtmedium och intracellulära lager. De allmänna reaktionerna möjliggör långsiktig överlevnad genom att samordna cellmetabolismen med näringstillgång och tillväxtpotential . Genomförandet av dessa strategier kräver förändringar i uttrycksprofilerna för hundratals gener, vilket transkriptomanalyser av Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) visar .

Under Pi-svält ökar växterna uttrycket av fosfataser som ett allmänt svar . Fosfatasproduktionen är kopplad till Pi-brist, och en positiv korrelation mellan produktion av surt fosfatas och Pi-näring har föreslagits . Till exempel producerar växter som lupiner, som är mer effektiva när det gäller att ta upp Pi från jorden, betydligt mer fosfatas jämfört med spannmål .

Wu et al. analyserade regleringen av proteinfosfataser i Arabidopsis och fann att tre gener för PAP inducerades av Pi-svält. Dessutom inducerades genen At1g25230 mer än 2 gånger, vilket visar att denna gen reagerar på Pi-svält.

I risgenomet identifierades totalt 26 putativa PAP-gener, och Pi-svält inducerade uttrycket av 10 PAP-gener för ris, vilket tyder på att dessa spelar viktiga roller i risets acklimatisering till låga Pi-förhållanden .

I Lycopersicon esculentum (tomat) induceras LePS2 av Pi-svält . Det noteras att LePS2-fosfataserna representerar de första cytoplasmatiska fosfataserna som är komponenter i Pi-svältresponsen . Att suspendera tomatceller i Pi-starved medium ledde till en PAP-specifik aktivitetsökning på ungefär 4 gånger, men den PAP-specifika aktiviteten förblev låg och konstant i celler som hölls i medium med hög Pi-halt. Ökningen av PAP-aktiviteten i celler som växer i Pi-starved medium visar att PAP kan ha en roll i att öka tillgängligheten och utnyttjandet av Pi och kan vara central för mobilisering av intracellulärt Pi genom att känna av brist på Pi i tomat .

5. Ektofosfataser som Pi-sensorer

Cellernas plasmamembran kan innehålla enzymer vars aktiva platser är vända mot det externa mediet snarare än mot cytoplasman. Aktiviteten hos dessa enzymer, som kallas ektoenzymer, kan mätas med hjälp av intakta celler . Ektofosfataser och ektokinaser har påvisats i flera mikroorganismer, inklusive protozoer, bakterier och svampar.

Många studier har visat att ektofosfataserna spelar en roll när det gäller att få Pi för användning i tillväxten av olika celltyper . I svampceller (Fonsecae pedrosoi) inducerar tydligen utarmning av Pi från kulturmediet uttrycket av olika ektofosfatasaktiviteter . Odling av dessa svampar i avsaknad av exogent Pi har visat sig resultera i generering av svampceller som uttrycker en ektofosfatasaktivitet som är 130 gånger högre än den som uttrycks av svampar som odlas i närvaro av Pi . Trypanosomatiska celler har ektofosfataser som ger Pi genom hydrolyseringen av fosfomonoestermetaboliter . Till exempel hos T. rangeli inducerar en låg Pi-koncentration i tillväxtmediet uttrycket av en annan ektofosfatasaktivitet , vilket tyder på att detta enzym leder till hydrolysering av fosforylerade föreningar som finns i det extracellulära mediet. Denna hydrolys skulle kunna bidra till att Pi anskaffas under utvecklingen av T. rangeli epimastigoter .

Under förhållanden med Pi-begränsning uttrycker fluorescerande bakterier Pseudomona en uppsättning gener för fosfathunger. Till exempel induceras minst 56 Pi-svältproteiner i P. putida-stammen KT2442 , och i P. fluorescens-stammen DF57 har induktion av flera fosfat-svältgener rapporterats .

I många eukaryoter är nukleotidpyrofosfatas/fosfodiesterasfamiljen (E-NPP) av proteiner direkt ansvarig för fosfathydrolys från extracellulära nukleotider. NPP1 till -3 finns i nästan alla mänskliga vävnadstyper och dessa enzymer innehåller en alkalisk ektonukleotidpyrofosfatas/fosfodiesteras typ 1-domän. I S. cerevisiae uppregleras NPP1 och NPP2 via Pi-reglerad transkription.

6. Avslutande kommentarer

Pi är en förening som är tillväxtbegränsande i olika organismer när dess tillgänglighet är låg i många ekosystem . Induktion av fosfatasaktivitet som svar på Pi-svält är ett vanligt fenomen bland organismer som får Pi från omgivningen. Dessa enzymer kan hydrolysa fosforylerade substrat för att tillhandahålla en källa till Pi under en brist på näringsämnen. I Saccharomyces cerevisiae utlöser Pi-hungersignalen en ökad produktion av minst fyra typer av fosfataser: (1) de sura fosfataserna Pho5, Pho11 och Pho12, som är lokaliserade i periplasmautrymmet, (2) det alkaliska fosfataset Pho8, som är lokaliserat i vakuolen, (3) glycerolfosfataset Hor2, (4) det förmodade polyfosfataset Phm5, som är lokaliserat i vakuolen. Alla dessa enzymer kan bidra till ökade nivåer av fritt Pi . Andra funktioner kan dock tillskrivas dessa enzymer.

Del Pozo et al. purifierade ett surt fosfatas, AtACP5, som induceras av Pi-svält i Arabidopsis thaliana. Detta enzym uppvisar två aktiviteter, hydrolys av fosforylerade substrat och peroxidbildning. Fosfatasaktiviteten speglar troligen en roll i Pi-mobiliseringen; peroxidationsaktiviteten tyder på att AtACP5 också skulle kunna spela en roll i ämnesomsättningen av reaktiva syrearter .

Tillsammantaget spelar Pi-svältinducerade fosfataser en roll i en organisms anpassning till stress, även om andra roller kan hittas.

Acknowledgments

Författarna tackar för det ekonomiska stödet från Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) och Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). C. F. Dick och A. L. A. Dos-Santos har bidragit lika mycket till detta arbete.