4.1. Mikrotubuli

Motorbulernas betydelse för FA-avveckling har påvisats med hjälp av nocodazol, som bryter upp polymeriserade MT:er i celler som är adherenta till ECM . Exponering av celler för nocodazol stabiliserar FA-strukturer genom att förhindra deras sönderdelning och förbättrar därmed cellernas vidhäftning till ECM. När läkemedlet avlägsnas från kulturmediet inleds nedmonteringen av FAs på ett synkront sätt och återhämtningen av MT-strukturerna . Användningen av detta läkemedel gör det alltså möjligt att analysera FA-avvecklingsprocessen oberoende av FA-bildningen. Tyrosinfosforylering av proteiner inom FA ökar efter exponering för nocodazol och minskar snabbt efter avlägsnande av läkemedlet. Utvidgning av MTs till FAs har observerats med levande bildmikroskopi, och inriktning av MTs på FAs verkar utlösa FA-avveckling . Eftersom MT:s motorprotein, kinesin-1, har involverats i regleringen av MT-inducerad FA-avveckling , kan MT:s leverera avvecklingsfaktorer till FA:s på ett kinesin-1-beroende sätt.

Eftersom förlängning av MT:s till FA:s utlöser frigörande av celladhesion och främjar cellmigration, är det av intresse hur målinriktning av MT:s till FA:s regleras under induktionen av cellmotilitet. Faktum är att GTPaser från Rho-familjen reglerar infångning och stabilisering av förlängda MTs till cellkortex via deras nedströms effektorer, och MTs i sin tur har visat sig påverka aktiviteten hos Rho GTPaser . Även om det inte är exakt klart hur MTs riktar FAs, spelar antagligen aktinfilamenten en roll.

4.2. Kinesin-1

Kinesin-1 är en medlem av kinesin superfamiljen av motorproteiner och är även känd som konventionell kinesin . Kinesin-1 spelar en avgörande roll i proteintrafiken längs polymeriserade MT:s i riktning mot plusändan av senare. Hämning av kinesin-1 i Xenopus fibroblaster, antingen med hjälp av en specifik antikropp eller forcerat uttryck av en dominant-negativ mutant, leder till stabilisering av FAs tillsammans med en ökning av deras storlek och en minskning av deras antal, vilket sågs i celler som exponerades för nocodazol . Dessa resultat tyder på att kinesin-1-aktivitet är nödvändig för omsättningen av FAs. Även om nocodazol hämmar polymeriseringen av MTs, påverkar hämning av kinesin-1-aktiviteten varken MTs inriktning på FAs eller polymerisationsdynamiken hos MTs . Detta tyder på att FA-avvecklingsfaktorer transporteras längs MTs på ett kinesin-1-beroende sätt.

4.3. Focal Adhesion Kinase

FAK är involverad i både mognad och omsättning av FAs . FAK-brist har dock en större effekt på nedmonteringen än på bildandet av FAs, vilket ger upphov till en minskad FA-omsättningshastighet som leder till en ökning av nivån av FAs i steady-state . FAK innehåller en N-terminal FERM-domän (protein 4.1, ezrin, radixin och moesin homology), en central kinasdomän och en COOH-terminal FAT-domän (focal adhesion-targeting) enligt figur 4. FERM-domänen finns i många proteiner och förmedlar protein-proteininteraktioner . FAK:s FERM-domän har visat sig binda CP av integrin β1 och tillväxtfaktorreceptorer . Nyligen genomförda strukturanalyser av FERM-domänen har visat att den binder till den katalytiska klyftan i kinasdomänen . Denna intramolekylära interaktion förhindrar autofosforylering av Tyr397, vilket är en förutsättning för den successiva fosforyleringen av FAK av Src. Autofosforylering av FAK vid Tyr397 är förhöjd i mycket rörliga och invasiva cancerceller . Src binder till den fosforylerade Tyr397 och fosforylerar vidare flera tyrosinrester inom FAK, inklusive Tyr576 och Tyr577 inom kinasdomänen, Tyr861 som ligger mellan kinas- och FAT-domänen och Tyr925 inom FAT-domänen . Fosforylering inom kinasdomänen är avgörande för full kinasaktivitet. Fosforylerat Tyr861 medierar FAK:s interaktion med talin och paxillin . Fosforylering vid Tyr925 är nödvändig för FAK:s interaktion med Grb2 . Bindning av Grb2 till FAK bidrar till att rekrytera dynamin till FAs . Detta ternära komplex är ansvarigt för internaliseringen av integriner och inducerar därmed omsättningen av FAs. FAK:s roll under FA:s nedmontering är dock inte så enkel. Medan pTyr397 FAK krävs för rekrytering av dynamin, induceras dess defosforylering efter förlängning av MTs till FAs, och detta är ett nödvändigt steg för den successiva nedmonteringen av FAs . FAK är således en central regulator för bildandet och nedmonteringen av FA:s och för överföringen av integrinmedierade signaler. FAK-brist har dock liten effekt på FA-bildningen, men har ändå visat sig stabilisera FAs. FAK:s roller under FA-bildningen kan utföras av andra redundanta kinaser eller faktorer som rekryteras till FA:s.

4.4. Dynamin

Dynamin är ett GTPas som identifierades som ett MT-bindande protein . Tre oberoende dynamingener har identifierats. Dynamin I uttrycks specifikt i neuroner och Dynamin III uttrycks uteslutande i testiklar, lungor och hjärna, medan Dynamin II uttrycks ubiquitärt . Den domänstruktur som är gemensam för dynaminerna visas i figur 4. Dynamin krävs för internalisering av integriner under MT-beroende FA-omsättning . Dynamins karboxylterminus innehåller ett prolinrikt (PR) motiv, som är oumbärligt för sammansättning av ett ternärt komplex med FAK och Grb2 . Dynamins PR-motiv interagerar också med MT. Dynaminer som rekryteras till cellmembranets inre yta samlas i en ring runt FAs och inleder internaliseringen av integriner när FAs är tillräckligt nedmonterade. FAK-brist minskar markant ackumuleringen av dynamin runt FAs . Samverkan mellan tubulinpolymeren och dynamin ökar markant den sistnämndas GTPasaktivitet, även om den fysiologiska betydelsen av detta är oklar .

4.5. Fosfataser

En specifik uppsättning proteintyrosinfosfataser medierar defosforylering av FAK vid Tyr397 efter förlängningen av MT:s till FA:s . Dessa inkluderar PTP-PEST, SHP-2 och PTP-1B. Det är dock inte klart om FA-avveckling kräver samlad verkan av alla tre fosfataserna eller om verkan av en enda fosfatas är tillräcklig, beroende på den cellulära kontexten.

PTP-PEST är känd för att reglera celladhesion och migration (figur 4) . Som Zheng et al. har rapporterat defosforylerar PTP-PEST FAK vid Tyr397 vid aktivering av en onkogen Ras-inducerad signal . Ras inducerar aktivering av ERK via kaskaden Fgd1-Cdc42-PAK1-MEK1 som i slutändan resulterar i interaktion mellan FAK och PTP-PEST. Aktiverad ERK fosforylerar FAK vid Ser910, och den fosforylerade Ser910 och den intilliggande Pro911-restigen tjänar som bindningsställe för peptidylprolyl cis/trans isomeras (PIN1). PIN1 stimulerar bindningen av FAK till PTP-PEST på ett sätt som är beroende av PIN1:s isomerasaktivitet, även om isomerasaktivitetens exakta roll inte är klarlagd. PTP-PEST defosforylerar sedan pTyr397 . Intressant nog främjar substitution av FAK Tyr397 med Phe metastasering av v-H-Ras-transformerade råttfibroblaster.

SHP-2 kan också defosforylera FAK vid Tyr397 . SHP-2 innehåller två SH2-domäner vid sin N-terminus (Figur 4), och den N-terminala mest av de två fungerar som en intramolekylär hämmare av fosfatasaktiviteten . Denna hämning kan lösas upp av Gab2, ett dockingprotein som innehåller en pleckstrin homology (PH)-domän (PH). Gab2 binder den N-terminala SH2-domänen och exponerar SHP-2:s fosfatasdomän genom att frigöra den intramolekylära hämmningen . Brist på SHP-2 i odlade celler ökar antalet FAs och försämrar cellmigrationen . Dessa resultat påminner om fenotypen hos FAK-bristande celler. Det finns dock inga tydliga bevis för att SHP-2 lokaliseras till FAs under deras omsättning. SHP-2 kan rekryteras till FAs genom att interagera med de fosforylerade tyrosinerna i Gab2 via sina två SH2-domäner.

Det finns flera substrat för PTP-1B i FAs, inklusive FAK, Src och α-actinin . PTP-1B är en komplicerad regulator av FAK. Den förmedlar direkt defosforylering av pTyr397 men kan också främja fosforylering av samma tyrosinrest av Src . Som Zhang rapporterade spelar α-actinin en nyckelroll i PTP-1B:s dubbla funktioner . α-actinin fosforylerat vid Tyr12 främjar dissociation av Src bundet till FAK vid pTyr397. Detta gör det möjligt för PTP-1B att avfosforylera den exponerade pTyr397. Å andra sidan kan PTP-1B avfosforyla α-actinin pTyr12 för att öka den α-actininfria Src-poolen som då är tillgänglig för fosforylering av FAK. Samtidigt kan PTP-1B aktivera Src genom att defosforylera Src pTyr527, vilket medierar intramolekylär hämning av Src-aktiviteten. Sammantaget ökar defosforylering av FAK av PTP-1B den efterföljande fosforyleringen av FAK av Src. Dessa funktioner hos PTP-1B kan spela roller i den dynamiska omsättningen av FAK under dynamisk cellfästning snarare än att enbart främja avlossning.

4.6. m-Calpain

m-Calpain, även känt som Calpain-2, är en medlem av calpain-familjen av intracellulära kalciumberoende proteaser . Den består av fem funktionellt och strukturellt skilda domäner. Domän I är en möjlig autoinhibitorisk region, och den klyvs av genom autolys. Domän II är en katalytisk domän som består av två delade subdomäner (IIa och IIb) som är sammanlänkade med en slinga som kallas den katalytiska klyftan. Domän III är en förmodad reglerande region för proteasaktiviteten och innehåller fosfolipidbindningsställen. Domän IV innehåller fyra EF-handmotiv som är nödvändiga för att binda kalcium.

m-Calpain har visat sig reglera omsättningen av FAs genom att klyva flera FA-relaterade proteiner som talin, FAK och paxillin . Talin är ett väletablerat substrat för m-Calpain under omsättningen av FAs . m-Calpain klyver en plats mellan huvud- och stavdomänerna och utlöser därmed strukturell nedbrytning av FA-ramverket . FAK klyvs också av m-Calpain mellan de två C-terminala PR-domänerna . För att m-Calpain ska kunna bryta ned FA:s krävs också MT:er . Även om MT:s exakta roll i m-Calpains nedbrytning av FA:s är oklar, spelar ZF21 förmodligen en roll, vilket förklaras i nästa avsnitt . FAK kan binda både ERK/MAPK och m-Calpain, och det kan vara en plattform där m-Calpain kan aktiveras av ERK/MAPK . Klyvning av komponenter i FAs av m-Calpain underlättar förmodligen internalisering av integriner genom att störa den sammankopplade stora strukturen i FAs.

4.7. ZF21

ZF21 innehåller en FYVE-domän som binder till fosfatidylinositol-3-fosfat som är anrikat i plasmamembranens lipidlager. Även om det finns 38 FYVE-domäninnehållande proteiner hos däggdjur har de inte nödvändigtvis gemensamma domänstrukturer eller funktioner . ZF21 uppmärksammades ursprungligen som en möjlig interaktionspartner till den cytoplasmatiska svansen av metalloproteinas av membrantyp, MT1-MMP, men det fastställdes senare att det är en regulator av FA-omsättningen . ZF21 uttrycks nästan ubiquitärt i olika typer av adhesiva celler. ZF21:s FYVE-domän är belägen i mitten av proteinet, och proteinets C-terminala region innehåller ett nytt proteinveck som liknar PH-domänen men saknar de positivt laddade aminosyror som är nödvändiga för att binda fosfolipid . Intressant nog binder ZF21 flera FA-avvecklingsproteiner, inklusive FAK, β-tubulin, m-Calpain och SHP-2 . ZF21:s FYVE-domän binder FAK och den PH-liknande domänen binder β-tubulin. Nästan hela ZF21:s polypeptidkedja krävs för att binda m-Calpain och SHP-2. Substitution av FYVE-domänen av ZF21 med en motsvarande domän som härrör från EEA1, en annan medlem av de FYVE-domäninnehållande proteinerna, upphäver dess förmåga att binda FAK och upphäver dess förmåga att förmedla MT-inducerad FA-avveckling .

Knockdown av ZF21-uttrycket i celler förhindrar MT-inducerad FA-avveckling, liksom avvecklingsrelaterade händelser, som t.ex. defosforylering av FAK vid pTyr397 och internalisering av integriner . Bindning av ZF21 till FAK är viktig för regleringen av FA-avveckling eftersom substitution av FYVE-domänen med EEA1-domänen upphäver både FAK-bindning och FA-avveckling . Den PH-liknande domänen är också oumbärlig för ZF21:s aktivitet . Sammantaget tyder dessa resultat på att ZF21 associerar sig med endosomala vesiklar som rör sig på MTs via en interaktion mellan FYVE-domänen och fosfatidylinositol-3-fosfat i vesikelns membran. Den PH-liknande domänen, som förmedlar en interaktion med β-tubulin, kan bidra till att stabilisera interaktionen mellan ZF21 och MTs för att sedan åka på vesiklar. ZF21:s förmåga att binda SHP-2 och m-Calpain kan underlätta transporten av de sistnämnda till FAs via vesiklar som lastas på MTs (figur 5). När MTs riktas till FAs kan ZF21 överföras till FAs eftersom det kan binda FAK, och ZF21 som överförs till FAs kan därefter förankra MTs till FAs. Gab2 i FAs kan underlätta avfosforyleringen av FAK av SHP-2 som bärs in på MTs. Dessa händelser följs förmodligen av en nedbrytning av FA-komponenterna genom den proteolytiska aktiviteten hos m-Calpain.

Figur 5

En modell för rekrytering av nedbrytningsfaktorer till FA:er. I denna modell transporterar ZF21 FA-avvecklingsfaktorer via intracellulär vesikeltransport på MTs. ZF21 associerar sig med endosomala vesiklar genom att binda till fosfatidylinositol-(3)-fosfat via sin FYVE-domän. m-Calpain och SHP-2 kan laddas på ZF21 som bärs av vesiklarna. ZF21 kan också finnas i FAs genom att interagera med FAK, och ZF21:s förmåga att binda β-tubulin kan fungera som en dockningsfunktion för de förlängda MTs i FAs för att avlasta de transporterade faktorerna på destinationen.

ZF21:s betydelse för cellmigrationen gav oss en ledtråd för att förstå dess roll i FA-omsättningen . Knockdown av ZF21-uttrycket med shRNA i cancerceller inducerade cellspridning på ECM och undertryckte cellmigrationen. Integrinmedierad celladhesion och migration är viktiga under cancercellers invasion och metastasering även om FA-liknande strukturer inte är uppenbart igenkännbara i de flesta celler omgivna av ECM. Knockdown av ZF21-uttrycket i celler från humant bröstcancer MDA-MB231 undertrycker metastatisk kolonibildning i lungan efter injektion av cellerna i svansvenen hos möss . Det är dock möjligt att ZF21 reglerar metastasering av cancerceller genom mekanismer som skiljer sig från regleringen av omsättningen av FAs.

5. Slutsats

Vår förståelse av mekanismen för omsättningen av FAs är fortfarande fragmentarisk. De mekanismer som styr cellernas migration på grund av reglerad vidhäftning är dock avgörande för förståelsen av cancercellers invasion och metastasering. Omsättningen av FAs initieras av förlängningen av MTs till FAs och avslutas av internaliseringen av integriner från cellytan. Flera faktorer har involverats i processen för avveckling av FAs. Särskilt den nyligen identifierade ZF21 har kastat ljus över denna process tack vare sin förmåga att binda flera proteiner som är involverade i FA-avvecklingen. Det är värt att notera att FA inte observeras i celler som odlas i ett kollagengitter, vilket tyder på att närvaron av integrinbaserade celladhesionsstrukturer är beroende av om cellerna fäster vid en styv yta (2D) eller om de är inbäddade i en tredimensionell ECM (3D) . Avancerad bildteknik är kraftfulla verktyg för att belysa de dynamiska rollerna av FA-avvecklingsfaktorer under cellmigration och invasion.