Vi valde 5′-UTR av den välstuderade CYC1-promotorn i S. cerevisiae. Vi fusionerade pCYC1min (med början vid position -143) med ett jästförstärkt grönt fluorescerande protein (yEGFP) och CYC1-terminatorn. Jämfört med den fullständiga CYC1-promotorn innehåller pCYC1min två av de tre TATA-boxarna och inga aktiverande sekvenser uppströms. pCYC1min är en måttligt svag promotor och verkar därför vara en idealisk kandidat för att detektera både positiva och negativa effekter av punktmutationer i ledarskapssekvensen på uttrycket av nedströmsreporterproteinet. CYC1-promotorns 5′-UTR är 71 nukleotider lång.

I följande analys hänvisar vi till den del av CYC1:s 5′-UTR som befinner sig på positionerna -1 till -8 som den förlängda Kozak-sekvensen och den som befinner sig på positionerna -9 till -15 som uppströmsregionen. I den utvidgade Kozak-sekvensen är adenin starkt bevarat i fem positioner, medan ingen nukleotid är starkt bevarad i uppströmsregionen. Adenin är dock den mest frekventa på nästan varje plats (se Bakgrund).

Den utvidgade Kozak-sekvensen

Den ursprungliga CYC1-sekvensen från positionerna -15 till -1 är CACACTAAATTAATA (hädanefter kallad k 0). Enligt Dvir et al. bör närvaron av ett adenin i positionerna -1, -3 och -4, tillsammans med frånvaron av guanin i position -2, göra denna ledarsekvens nästan optimal för högt uttryck. Thymin i position -2 och cytosin i position -13 har dock en frekvens som är lägre än 20 % respektive 10 % bland högt uttryckta gener från S. cerevisiae . Vi byggde vår första syntetiska CYC1-ledarsekvens (k 1) genom att placera ett adenin på varje position från -1 till -15.

Fluorescensnivån i samband med k 1 var 6,5 % högre än den som uppmättes med k 0. Ingen statistiskt signifikant skillnad uppstod dock från de data som samlades in om dessa två ledarsekvenser (p-värde = 0,13). Vi behöll k 1 (den optimerade ledarsekvensen) som mall för våra nästa syntetiska konstruktioner och byggde ytterligare 57 syntetiska 5′-UTR:er genom att mutera en eller flera nukleotider i k 1.

Den första gruppen syntetiska ledarsekvenser skapades genom en enda punktmutation från position -1 till position -8 (se tabell 1). Därför modifierade vi endast den förlängda Kozak-sekvensen, medan uppströmsregionen behölls i en optimerad konfiguration för högt genuttryck med adeniner vid positionerna -9 till -15.

Den högsta fluorescensen uppmättes för k 16 (där ett guanin ersatte adeninet i position -5) och den lägsta av k 9 (där ett tymin ersatte adeninet i position -3). Dessutom var fluorescensnivån för k 16 statistiskt signifikant annorlunda än för k 0 och k 1. En förstärkning av fluorescensen på grund av ett guanin i position -5 var ett överraskande resultat eftersom guanin är den minst frekventa nukleotiden i ledarsekvenser i jäst S. cerevisiae. Dessutom upptäcktes aldrig något guanin på denna position bland högt uttryckta gener eller framkallade någon fluorescensförstärkning i arbetet av Dvir et al. .

Trots avsaknaden av en statistiskt signifikant skillnad från k 1 var de enda konstruktioner förutom k 16 som resulterade i en ökning av >5 % på fluorescensnivån för k 1 k 3, k 10 och k 24. I k 3 ersatte ett tymin ett adenin i position -1, och i k 10 muterades adeninet i position -3 till ett guanin. Som rapporterats ovan bör adenin i positionerna -1 och -3 garantera ett högt genuttryck. På en sådan adeninbakgrund verkar dock mindre frekventa nukleotider vid positionerna -1 eller -3 krävas för att ytterligare öka genuttrycket. Däremot var ett tymin i stället för ett adenin i position -3 (k 9) den enda mutation som gav upphov till en >5 % minskning av k 1-fluorescensnivån. Detta resultat stämmer överens med observationen i att ett tymin på position -3 är rikligt förekommande i svagt uttryckta gener (fig. 1 a).

Med avseende på k 0 innehöll alla 25 nya syntetiska ledarsekvenser mellan sex och åtta mutationer. Bortsett från k 9 uppvisade alla syntetiska 5′-UTR:er en fluorescensnivå som var högre än k 0, varav fem var signifikant högre. Dessa omfattade positionerna -1, -4 och -5. Som redan noterats i jämförelsen med k 1 tycktes ett adenin strax uppströms START-kodonet inte vara till någon särskild fördel för genuttrycket. Här presterade ett cytosin och ett tymin (k 2 respektive k 3) mycket bättre än ett adenin. När det gäller k 0 fanns det dock sju fler punktmutationer uppströms. Vid position -4 resulterade ett tymin (k 12) i den högsta fluorescensökningen, medan vid position -5 både ett cytosin (k 14) och ett guanin (k 16) ökade fluorescensen till >10 % över den för k 0. Eftersom k 0 har ett tymin i positionerna -2, -5 och -6, påverkades var och en av de fem syntetiska 5′-UTR som visade statistiskt signifikanta skillnader från k 0 av en punktmutation på två eller flera intilliggande platser. Ytterligare tre syntetiska ledarsekvenser (k 10,k 17 och k 24) orsakade en >10 % ökning av fluorescensen jämfört med k 0, även om dessa skillnader inte var signifikanta (p-värde >0,05). k 10 och k 17 hade också dubbla punktmutationer på intilliggande platser (fig. 1 b).

Mångfaldiga mutationer till guanin

Analysen av våra första 25 syntetiska 5′-UTR-sekvenser gav det överraskande resultatet att en enda punktmutation till guanin – som i stort sett saknas i den förlängda Kozak-sekvensen för högt uttryckta S. cerevisiae-gener – kan öka fluorescensnivån hos k 1, en ledarsekvens som optimerats för genuttryck. Dessutom ökade fem av våra syntetiska 5′-UTR:er otvetydigt (>9 %) den fluorescensnivå som är förknippad med pCYC1min.

Enligt våra data kan en enda mutation till guanin öka genuttrycket. Två tidigare artiklar rapporterade dock att flera guaniner placerade framför ett START-kodon skulle minska proteinsyntesen avsevärt. Därför bedömde vi hur flera punktmutationer till guanin påverkade översättningseffektiviteten hos pCYC1min, för att avgöra om de kan användas för att modulera genuttrycket.

Enligt , bland högt uttryckta gener i S. cerevisiae är guanin den minst frekventa nukleoiden mellan positionerna -1 och -15, med undantag för position -7, där den minst frekventa nukleoiden är cytosin. Vi konstruerade en syntetisk 5′-UTR som återspeglar denna sekvens (k 26; tabell 2). Detta stängde av genuttrycket, vilket visades av att motsvarande fluorescensnivå inte skiljde sig signifikant (p-värde =0,21) från vår negativa kontroll (en S. cerevisiae-stam som inte innehöll yEGFP-genen).

Vi testade om multipla mutationer till guanin (cytosin i position -7) skulle påverka genuttrycket på ett annat sätt när de täckte antingen hela den förlängda Kozak-sekvensen (k 27) eller uppströmsregionen (k 28). Eftersom mutationerna gjordes med avseende på k 1 innehöll alla icke-muterade platser ett adenin. Överraskande nog fann vi att de två konfigurationerna var likvärdiga för genuttryck (p-värde >0,40) och minskade k 1-fluorescensnivån med ungefär hälften.

Med utgångspunkt från k 27 ersatte vi guaninet på positionerna -1 (k 29), -2 (k 30) och -3 (k 31) med ett adenin för att avgöra om ett enda adenin på de tre positionerna strax uppströms START-kodonet skulle öka fluorescensuttrycket när de andra platserna i den förlängda Kozak-sekvensen var upptagna antingen av ett guanin eller ett cytosin. På position -1 visade ett adenin ingen förbättring av fluorescensen hos k 27. Intressant nog orsakade ett adenin vid positionerna -2 och -3 en minskning av genuttrycket till ungefär 7 % av k 1-fluorescensnivån. Dessa resultat visar att ett adenin i sig inte kan förbättra genuttrycket även när det intar position -3 eller -1. Mer allmänt kan vi dra slutsatsen att effekten på genuttrycket av en enskild punktmutation i ledarsekvensen är starkt kontextberoende.

För att bättre förstå hur viktig uppströmsregionen är för genuttrycket minskade vi slutligen successivt antalet guaniner från sju (k 28) till ett (k 38). Från position -9 ersatte vi ett guanin med ett adenin i varje steg och såg att fluorescensnivån ökade nästan linjärt med antalet adeniner (fig. 2 och Additional file 1). Den sista sekvensen där fluorescensnivån var statistiskt signifikant annorlunda än k 1 var k 36, där guaniner fanns i positionerna -13 till -15. Ett guanin ensamt i position -15 eller tillsammans med ett annat i position -14 resulterade inte i någon signifikant skillnad i fluorescensnivå jämfört med k 1. Även i närvaro av en förlängd Kozak-sekvens som är optimerad för högt genuttryck har därför flera mutationer i uppströmsregionen uppenbara återverkningar på proteinsyntesen och kan användas som ett sätt att ställa in proteinöverflödet. En förklaring till detta resultat presenteras i avsnittet Beräkningsanalys nedan. Intressant nog minskade fyra guaniner blandade med adeniner (k 33) i uppströmsregionen k 1-fluorescensen i mindre utsträckning än fyra guaniner på rad (k 32), vilket ger ytterligare bekräftelse på att effekten på genuttrycket av punktmutationer inne i 5′-UTR i hög grad är beroende av nukleotidkontexten (Fig. 2; se Additional file 1 för en jämförelse med k 0-fluorescensen).

The upstream region

Den tidigare analysen bekräftade att effekten på genuttrycket till följd av både enstaka och multipla mutationer inom 5′-UTR är starkt kontextberoende. Dessutom visade våra data tydligt att förändringar inte bara i Kozak-sekvensen utan även inne i uppströmsregionen påverkar genuttrycket markant. Vi utförde därför punktmutationer på k 1 mellan positionerna -9 och -15 (tabell 3) för att bedöma om en enda nukleotid som skiljer sig från adenin kan förändra translationshastigheten när den placeras i uppströmsregionen.

Alla punktmutationer (utom den i k 38) resulterade i en fluorescensnivå som var högre än den som var associerad med k 1. Noterbart är att i åtta fall var ökningen av fluorescensen statistiskt signifikant (>10 % högre än k 1-fluorescensen). Dessa åtta mutationer omfattade fyra sammanhängande positioner, från -11 till -14. Ingen av dessa beaktades i referensarbetet av Dvir et al. .

På position -11 ökade ett guanin i stället för ett adenin (k 47) fluorescensuttrycket med >15 %, medan cytosin och tymin inte hade någon signifikant effekt. Varje mutation i position -12 ökade fluorescensen av k 1. Den största förändringen (>15 %) berodde på ett guanin (k 50). Mutationer vid position -13 ökade också kraftigt k 1-fluorescensnivån. Två punktmutationer – cytosin (k 51) och guanin (k 53) – resulterade i statistiskt signifikanta skillnader i fluorescens från k 1, medan ett tymin (k 52) ökade k 1-fluorescensen med ca 14 %, men detta uppnådde inte statistisk signifikans. Det bör noteras att bland alla våra 58 syntetiska 5′-UTR:er hade k 51 den högsta fluorescensnivån – nästan 17 % högre än k 1.

Slutligen ledde två olika punktmutationer på position -14 till en ökning av fluorescensen: ett cytosin (k 54) och ett tymin (k 55) (Fig. 3; se Additional file 1 för en jämförelse med k 0).

Totalt understryker resultaten av denna sista analys av uppströmsregionen ett annat överraskande resultat: Enstaka punktmutationer uppströms Kozak-sekvensen, särskilt vid positionerna -12 och -13, var de som mest förstärkte genuttrycket från en kontext rik på adeniner.

Beräkningsanalys

Vi utförde simuleringar med RNAfold för att undersöka eventuella korrelationer mellan beräknade sekundärstrukturer för mRNA, tillsammans med deras motsvarande minimala fria energier (MFE), och uppmätta fluorescensnivåer. Vår analys ger en förklaring till nedgången i fluorescens på grund av flera mutationer från adenin till guanin (och cytosin) i regionen -15…-1. Däremot framkom ingen rimlig motivering för effekterna av enstaka punktmutationer på translationseffektiviteten vid simuleringar med RNAfold.

Som indata för RNAfold använde vi mRNA-sekvenser som började vid transkriptionens startplats i pCYC1min och slutade vid poly-A-platsen i CYC1-terminatorn . Varje sekvens var 937 nukleotider lång. Från preliminära simuleringar observerade vi att en poly-A-kedja med en variabel längd på 150-200 nukleotider inte hade någon betydande effekt på mRNA-veckningen. Alla sekundärstrukturer för mRNA beräknades vid 30 °C (den temperatur vid vilken vi odlade S. cerevisiae-celler för FACS-experimenten).

k 0 och k 1 har samma MFE: -241,21 kcal/mol. Detta är den högsta – och den vanligaste – i den samling av 59 sekvenser som analyserats i detta arbete (se Additional file 1). Sekundärstrukturen för mRNA som motsvarar denna MFE kännetecknas av att det finns en gigantisk hårnål mellan positionerna -40 och +10. Hårnålsslingan går från position -31 till position +1 och innehåller hela den del av 5′-UTR som vi här har riktat in oss på. Hårnålsstammen består av nio baspar, varav endast ett gav en ”mismatch” på grund av ett adenin i position -38 och +8 (se fig. 4 a).

Mångfaldiga mutationer till guaniner antingen i uppströmsregionen eller i den förlängda Kozak-sekvensen ger upphov till basparningsinteraktioner mellan åtminstone en del av -15…-1-regionen och CDS (yEGFP) eller CYC1-terminatorn. Som en följd av detta förstörs den jättelika hårnålen och ersätts av en eller två stammar som sänker MFE för mRNA:s sekundärstruktur (tabell 2). De flesta MFE-värden som var mindre än -241,21 kcal/mol var förknippade med fluorescensnivåer som var lägre än k 1 (fig. 5). Detta resultat stämmer överens med uppfattningen, som också stöds av , att stabila sekundärstrukturer för mRNA i 5′-UTR minskar proteinuttrycket. De fluorescensnivåer som vi mätte ökade dock inte proportionellt till ökningar i MFE. I två fall (k 32 och k 36) förutspådde RNAfold dessutom en jättehårnål i mRNA-strukturen, medan fluorescensnivåerna från våra experiment var betydligt lägre än för k 1 (fig. 5 och Additional file 1).

k 26 utformades genom att välja de minst frekventa nukleotiderna mellan positionerna -15 och -1 bland en uppsättning högt uttryckta S. cerevisiae-gener. Motsvarande MFE (-261,39 kcal/mol) var den lägsta inom den ensemble av transkriptionsenheter som beaktas i detta arbete. Ingen jättehårnål fanns i MFE-mRNA-sekundärstrukturen eftersom regionen -15…-1 var sekretessbelagd i två olika stammar. Guaninerna mellan positionerna -1 och -6 ingick i en lång stam och parades med en hexamer i början av yEGFP-sekvensen (positionerna +33 till +38). Däremot parades positionerna -9 till -15 med en region av CYC1-terminatorn, vid positionerna +750 till +758 (fig. 4 b).

En fluorescensnivå strax över den för k 26 registrerades för k 30 och k 31. Båda skiljer sig från k 26 genom uppströmsregionen (bestående av sju adeniner) och närvaron av en adenin i den förlängda Kozak-regionen (vid positionerna -2 respektive -3). I likhet med k 26 var de fem första nukleotiderna i den utvidgade Kozak-regionen i k 30 och de sex första nukleotiderna i k 31 inkapslade i en stam med CDS. Till skillnad från k 26 var dock uppströmsregionerna av k 30 och k 31 helt fria från parningsinteraktioner (se figur 4 b). Deras MFE (-244,28 respektive -247,26 kcal/mol) var också betydligt högre än för k 26. Dessa tre sekvenser tyder på att ett villkor för att markant sänka proteinuttrycket är att innesluta nukleotiderna i positionerna -1 till -5 i en sekundärstruktur för mRNA. Dessutom behöver inte alla dessa nukleotider delta i basparningsinteraktioner. Ett guanin i position -1 (k 30) eller -2 (k 26 och k 31) är i själva verket ”fritt” och ansvarar för närvaron av en minislinga i mRNA-strukturen.

Denna hypotes motsägs dock av k 29. MFE för denna sekvens (-245,97 kcal/mol) är jämförbar med den för k 30 och k 31, och motsvarande sekundärstruktur för mRNA är mycket lik den för k 31 (fig. 6 a). Trots detta var fluorescensnivån associerad med k 29 mer än 6 gånger högre än för k 31 och uppgick till 45 % av den för k 1.

k 27 delade med k 29- k 31 en uppströmsregion som endast består av adeniner. Till skillnad från dessa tre sekvenser innehöll dock den förlängda Kozak-sekvensen av k 27 inget adenin. MFE för k 27 (-247,04 kcal/mol) var jämförbar med den för k 29- k 31, men dess motsvarande mRNA-sekundärstruktur hade en annan konfiguration. Alla nukleotider i den förlängda Kozak-sekvensen (med undantag för cytosinet i position -7) var faktiskt involverade i basparningsinteraktion inte med CDS utan med CYC1-terminatorn (positionerna +755 till +762; fig. 6 a). Fluorescensnivån för k 27 var något högre än för k 29, dvs. nästan 7 gånger högre än för k 31.

De fem sekvenser som hittills beaktats (k 26, k 27, k 29- k 31) har gemensamt en förlängd Kozak-region som är rik på guanin och som var sekretessbelagd i en stam i sekundärstrukturen för MFE-mRNA. I fyra fall parades den förlängda Kozak-sekvensen (delvis) med CDS och i ett fall (k 27) med CYC1-terminatorn. MFE för k 26 var den lägsta, eftersom dess uppströmsregion också var sekretessbelagd i en stam. De övriga fyra sekvenserna uppvisade mycket liknande MFE-värden men ganska olika fluorescensnivåer.

Den andra gruppen av sekvenser som påverkades av multipla mutationer med avseende på k 1 hade endast adeniner i den förlängda Kozak-sekvensen och ett varierande antal guaniner i uppströmsregionen.

k 28, k 34 och k 35 hade respektive 7, 6 och 5 guaniner i en rad från position -15 nedströms. Även om MFE för k 35 var klart högre än för k 28 och k 34 (tabell 2) gav de tre sekvenserna upphov till liknande mRNA-strukturer där minst fem guaniner i uppströmsregionen (plus det första adeninet nedströms) var låsta i en stam på grund av basparningsinteraktioner med CYC1-terminatorn (se figur 6 b).

Interessant nog var både MFE och fluorescensnivå för k 28 jämförbara med dem för k 27 och k 29. Även om Kozak-sekvensen var fri från parningsinteraktioner var alltså sekvenseringen av uppströmsregionen i en stam tillräcklig för att garantera en tydlig minskning av proteinuttrycket. Detta är ytterligare en bekräftelse på den roll som nukleotiderna uppströms Kozak-sekvensen spelar när det gäller att ställa in proteinuttrycket.

En annan sekundärstruktur för MFE-mRNA erhölls för k 33 (fyra guaniner, blandat med adeniner), där hälften av den förlängda Kozak-sekvensen och nästan hela uppströmsregionen var involverade i basparningsinteraktioner med CDS:en, vilket gav upphov till en lång stam. Jämfört med k 35, där endast fem nukleotider av uppströmsregionen var låsta i en stam med CYC1-terminatorn, uppvisade dock k 33 en högre MFE samt en högre fluorescensnivå (fig. 5 och Additional file 1).

För k 32, k 36 och k 37 (med fyra, tre respektive två guaniner i uppströmsregionen) gav RNAfold slutligen samma MFE som för k 1. Motsvarande sekundärstrukturer för mRNA kännetecknades alla av närvaron av den jättelika hårnålen (se tilläggsfil 1). Jämfört med våra experimentella data var detta resultat rimligt endast för k 37 men i uppenbar oenighet med mätningarna för k 32 och k 36, vars fluorescensnivåer var betydligt lägre än för k 1 (fig. 5). I synnerhet motsvarade fluorescensen för k 32 endast cirka 69 % av fluorescensen för k 1. Därför kan man hävda att k 32 och k 1 in vivo har samma MFE och mRNA-sekundärstruktur, vilket simuleringarna in silico tyder på.

I motsats till de multipla punktmutationerna var det av de enskilda punktmutationerna på k 1 endast k 4 som orsakade en ändring av strukturen hos den jättelika hårnålen och en därav följande minskning av MFE. k 4 har ett guanin i position -1 som parar sig med cytosin i position -31 så att slingans längd minskas från 32 till 29 nukleotider och MFE sänks till -241,42 kcal/mol (fig. 4 a). Enligt våra data har denna minimala förändring ingen effekt på fluorescensuttrycket. Alla andra punktmutationer som inducerade en fluorescensnivå som var betydligt högre än k 1 (nämligen k 16, k 47- k 51 och k 53- k 55) kännetecknades av samma MFE och motsvarande mRNA-sekundärstruktur som k 1, enligt RNAfold-simuleringarna.