1775 återvände Biddle till Nordamerika för att erbjuda sina tjänster till delstaten Pennsylvania som motsatte sig det brittiska styret. När det amerikanska revolutionskriget bröt ut placerade Pennsylvanias säkerhetskommitté Biddle som befälhavare över den beväpnade galären Franklin. I december 1775 blev Biddle inskriven i den kontinentala flottan och blev kapten på den 14-kalibriga briggen Andrew Doria.

Biddle deltog i expeditionen mot New Providence och stred i den kontinentala flottans strid med HMS Glasgow den 6 april 1776. Biddle var mycket kritisk till aktionen och noterade att kommendörkapten Esek Hopkins brist på signalering ledde till en ”helter skelter”-aktion. Biddle skulle senare erövra många fartyg, inklusive brittiska armétransporter, under senare kryssningar.

Biddle deltog senare i en kryssning av Newfoundland Banks som var så framgångsrik när det gällde att erövra fartyg att när Biddle återvände till hamnen hade han bara fem sjömän kvar ombord på sitt fartyg; resten bemannade de priser som togs under kryssningen.

Den 6 juni 1776 utsågs Biddle av den kontinentala kongressen till befälhavare för Randolph, en fregatt med 32 kanoner som då höll på att byggas i Philadelphia. Hon sjösattes i slutet av året och seglade i början av 1777. I september 1777 erövrade Biddle HMS True Briton och hennes konvoj med tre fartyg.

Den 7 mars 1778, utanför Barbados, angrep Randolph det brittiska 64-kalibriga linjeskeppet HMS Yarmouth. Istället för att försöka fly från den mer tungt beväpnade motståndaren, engagerade sig Randolph i striden för att skydda en amerikansk handelskonvoj. Ett ögonvittne rapporterade att fregatten höll stånd under den tjugo minuter långa striden och verkade ”avfyra fyra eller fem bredsidor mot Yarmouths en”. Efter att Biddle sårades exploderade Randolph plötsligt och dödade alla utom fyra av de 305 ombord, inklusive Biddle. Förlusten av Randolph var ett allvarligt slag för den nyblivna kontinentala flottan. Hans kropp gick förlorad till havs och återfanns aldrig.

Hans bror, Edward Biddle, var en övertygad förespråkare för amerikansk självständighet, och hans brorson, Nicholas Biddle, var en ansedd bankir.

Fyra fartyg i USA:s flotta har fått namnet USS Biddle till hans ära.

Cyrus Townsend Bradys bok For Love of Country bygger delvis på Nicholas Biddles liv.