Synonymer

Non-esterifierade fettsyror (NEFA), fria fettsyror, omättade fettsyror

Fysiologi

Non-esterifierade (”fria” eller omättade) fettsyror (NEFA) är den viktigaste beståndsdelen i triglycerider (kroppens fettdepåer), som består av tre fettsyror som är kopplade till en glycerolryggrad. Hos friska djur (när de äter eller inte befinner sig i energibristtillstånd) kommer NEFAs huvudsakligen från nedbrytning av triglycerider som intagits genom kosten via chylomikroner (lipoproteinlipas frigör NEFA från chylomikronrester). Vid fasta eller negativ energibalans är dock den huvudsakliga källan till NEFA hydrolys av fettdepåer i kroppen.

Hydrolys av lagrade triglycerider (fett) i fettvävnad av hormonkänsligt lipas frigör NEFA och glycerol. Hormonkänsligt lipas (som finns i cytosolen i adipocyter) stimuleras av olika hormoner, inklusive glukagon (som frisätts från α-celler i bukspottkörtelns öar som svar på låg glukos) och kortikosteroider. När NEFAs har frigjorts från fett eller chylomironer kan de användas som energikälla av många vävnader, inklusive skelettmuskulatur och hepatocyter. I hepatocyter varierar deras öde beroende på energibehov, hormonbalans och substrattillgång, dvs. de kan användas för energiproduktion (via Kreb-cykeln), ompaketeras till triglycerider och exporteras som lipoproteiner med mycket låg densitet (VLDL) eller lagras i levern som triglycerider (som i överskott kan orsaka hepatisk lipidos) eller omvandlas till ketoner.

Metodik

Den primära metoden för att mäta koncentrationen av NEFAs i serum är en kolorimetrisk enzymatisk metod, vilket är den metod som används vid Cornell University.

Reaktionstyp

Blanked end-point reaction. Blanking minskar effekten av hemolys på NEFA-koncentrationerna.

Förfarande som används vid Cornell University

I det första steget av denna trestegsreaktion katalyserar acyl-CoA-syntetas (ACS) acyleringen av NEFA till (koenzym A) CoA vilket resulterar i bildandet av acyl-CoA. Väteperoxid genereras sedan från oxidationen av acyl-CoA genom katalytisk verkan av acyl-CoA-oxidas (ACOD). Slutligen möjliggör väteperoxid i närvaro av peroxidas (POD) den oxidativa kondensationen av 4-aminoantipyrin med 3-metyl-N-etyl-N-(β-hydroxietyl)-anilin (MEHA) för att bilda en blå-lila slutprodukt med en maximal absorbans vid 550 nm. NEFA-koncentrationen är direkt proportionell mot den uppmätta optiska densiteten hos färgämnesprodukten.

Reaktioner visas nedan:

NEFA+ ATP + CoA acyl-CoA syntesas > Acyl-CoA + AMP + pyrofosfat

Acyl-CoA + O2 + acyl-CoA oxidas > 2,3-trans-Enoyl-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipyrin + MEHA-peroxidas > blå-lila komplex+ 3H2O

Måttenheter

Koncentrationen av NEFAs mäts i mEq/L (konventionella enheter) eller mmol/L (SI-enheter). Enhetsomvandlingen erhålls från följande formel:

mEq/L x 1= mmol/L

Provöverväganden

Provtyp

Serum eller EDTA-plasma. Serum/plasma ska separeras från cellerna så snart som möjligt efter insamlingen och serumet/plasman ska placeras i ett separat rör. På samma sätt rekommenderas inte corvac-rör (serumseparator), eftersom värdena är något (men signifikant) högre i dessa rör jämfört med icke antikoagulerande (röd topp) rör.

Antikoagulerande

EDTA. Värdena är mindre stabila i heparin, som också ger högre baslinjekoncentrationer än EDTA eller serum och NEFA-värdena ökar med lagring (Stokol och Nydam 2005).

Stabilitet

Stabilt i bovint serum eller EDTA-plasma vid 4°C i 72 timmar. Stabilt fryst i serum från nötkreatur i 1 månad (-70°C). Värdena ökar inom 24-48 timmar efter förvaring vid 24 °C i serum eller EDTA-plasma. NEFA-koncentrationerna ökar snabbt i heparin efter lagring. (Stokol och Nydam 2005).

Rekommendationer för provtagning hos övergångsmjölkkor

• Antikoagulantia: Röd topp (serum) eller lila topp (EDTA). Undvik heparin (grön topp) och corvac (serumseparator) rör.
• Hantering: Separera från cellerna snarast möjligt, förvara dem svalt för att minimera falska förändringar i resultaten (NEFAs är särskilt instabila), skicka in dem snarast möjligt till laboratoriet.
• Tidpunkt för insamling: Provtagning: Ta prov på korna när de kommer in i utfodringsboxarna (se nedan).
  • Prepartum NEFAs: Ta prover från kor 2-14 dagar före kalvning.
  • Postpartum NEFAs: Ta prover från kor 3-14 dagar efter mjölkning. Mätning av både postpartum NEFAs och BHB utförs i en energiprofil för övergångskossor för bedömning av energistatus hos lakterande kor vid laboratoriet för klinisk patologi vid Cornell University.
• Antal kor: Minst 12 djur per besättning bör provtas för testning på besättningsnivå (testbeskrivning i avsnittet om testtolkning nedan). Detta kan vara en blandning av kvigor och >2 paritetskossor.
• Poolade prover: Sammanläggning av enskilda prover från kor för att bedöma en besättnings energistatus rekommenderas INTE. Studier vid Cornell University har visat att resultat från sammanslagna prover är mindre känsliga än testning av enskilda kor (minst 12 djur per besättning) när man använder NEFA före eller efter födseln för att upptäcka överdriven negativ energibalans hos mjölkkor i övergångsfasen.

Interferenser

• Lipemi, ikterus: Okänd effekt (sällsynt hos nötkreatur).
• Hemolys: Beroende på vilken metod laboratoriet använder kommer hemolys antingen att minska eller öka NEFA-värdena. Med den blanka metod som används vid Cornell University kommer allvarlig hemolys (hemolytiskt index > 800 enheter) att minska NEFA-koncentrationerna i nötblod på ett lindrigt sätt. Lipemiska och ikteriska interferenser påverkar inte NEFA-koncentrationen nämnvärt med de metoder som används vid Cornell University.
• Excitering/övning/stress: Dessa förhållanden, som framkallar frisättning av katekolaminer eller ACTH, ökar NEFA-koncentrationerna genom att stimulera lipolysen genom hormonkänsligt lipas. Dessa förhållanden bör minimeras vid insamling av blodprover för NEFA-mätning.
• Tidpunkt för provtagning: Det är troligt att NEFA-värdena är högre hos kor som kommer in för daglig utfodring (de har troligen en viss negativ energibalans) jämfört med de kor som just har utfodrats (lipolysen kommer att hämmas hos de senare korna). Insamling strax före utfodring rekommenderas.

Testtolkning

NEFA-testning görs oftast på mjölkkor för att avgöra om besättningen befinner sig i alltför negativ energibalans. Det används mer som ett test på besättningsnivå än på individnivå för enskilda djur och resultaten tolkas med avseende på en gränsvärdekoncentration eller procentandel av djur med värden över gränsvärdet jämfört med värden över den övre referensgränsen. NEFA-mätning kan göras på alla andra djurarter som en markör för överdriven negativ energibalans. Detta görs oftast hos kameldjur (som utvecklar hepatisk lipidos under dessa omständigheter), andra idisslare (t.ex. getter, får) för att avgöra om de löper risk att drabbas av ketos, och hästar (vid ekvint metaboliskt syndrom). Observera att koncentrationer under referensgränsen inte är kliniskt relevanta.

Förhöjda koncentrationer

• Fysiologiskt: Träning inducerar frisättning av katekolaminer och ACTH, vilket stimulerar den hydrolytiska aktiviteten hos hormonkänsligt lipas för att främja fettmobilisering för att tillgodose överskott av energibehov. Denna process ökar koncentrationen av NEFA i blodet.
• Rasskillnader: Flera studier har visat att NEFAs är lägre hos Jerseykor post partum än hos Holsteinkor, varför riktlinjer som utvecklats för Holsteinkor (se nedan) kanske inte är tillämpliga på Jerseykor (Rastani et al 2001, French 2006, Guretsky et al 2006, Brown et al 2012).
• Negativ energibalans hos mjölkkor: Mjölkkor i den periparturala perioden (övergångsperioden) befinner sig alltid i ett tillstånd av negativ energibalans på grund av det höga energibehovet från det utvecklande fostret och mjölkproduktionen (särskilt med betoning på selektion för höga mjölkproducenter). Detta tillstånd av negativ energibalans kan dock vara överdrivet och drabbade kor löper risk att drabbas av gastrointestinala (förskjuten bukspalt), metaboliska (klinisk ketos) och infektiösa sjukdomar (t.ex. metrit) under den tidiga postpartumperioden. Därför övervakar mjölkproducenter ofta mjölkbesättningar för att upptäcka överdriven negativ energibalans genom att testa NEFAs, antingen enbart hos kor före eller efter förlossningen eller som en del av en metabolisk profil hos kor efter förlossningen. Resultaten av dessa tester kan tolkas på individnivå (dvs. att ett NEFA-värde över ett visst gränsvärde indikerar en alltför negativ energibalans) eller på besättningsnivå (dvs. att en andel av de testade korna har NEFA-värden över ett visst gränsvärde). Identifiering av överdriven negativ energibalans hos enskilda kor (och ännu viktigare) i besättningen visar att det finns behov av förändringar i utfodringen (t.ex. ökat utrymme för utfodring i liggbås, ökad energitäthet i ransonen) och i hanteringen av övergångskorna för att minska energibehovet och stressen hos övergångskorna. Följande tolkningsriktlinjer är baserade på studier vid Cornell University och gäller för prover som samlats in från TMR-utfodrade Holsteinkor som befinner sig i riskzonen mellan 2-14 dagar före kalvning (prepartum NEFAs) eller 3-14 dagar efter kalvning (postpartum NEFAs). Vi rekommenderar att prover tas från minst 12 ”riskkor” när man utvärderar besättningar med totalblandad ranson (TMR) för subklinisk ketos (Ospina et al. 2013).
  • Testning på ko-nivå
    • Prepartum NEFAs: Det finns en ökad förekomst av sjukdomar efter kalvning (förskjuten bukspalt, metrit/fasthållen placenta och klinisk ketos), minskad mjölkavkastning och minskad reproduktionsförmåga under de första 30 dagarna i mjölk hos Holstein-mjökor (utfodrade med TMR) med NEFA-värden > 0,30 mEq/L när de testas 2-14 dagar före kalvning.
    • NEAF-värden efter kalvning:
    • NEAF-värden efter kalvning: Det finns en ökad förekomst av sjukdomar efter kalvning (förskjuten buk, metrit/fasthållen placenta och klinisk ketos), minskad mjölkavkastning och minskad reproduktionsförmåga under de första 30 dagarna i mjölk hos Holstein-mjökor (utfodrade med TMR) med NEFA-värden > 0,60-0,70 mEq/L när de testas 3-14 dagar efter kalvning. I Cornell-studierna var NEFAs efter kalvning faktiskt en bättre prediktor för än β-hydroxybutyratkoncentrationer efter kalvning eller NEFAs före kalvning.
  • Testning på besättningsnivå
    • Prepartum NEFAs: På besättningsnivå finns det en signifikant ökad risk för metaboliska och infektiösa sjukdomar efter kalvning, minskad mjölkproduktion eller minskad reproduktionsförmåga om >15 % av de testade korna före kalvning har NEFA-värden > 0,30 mEq/L. Observera att, som anges ovan, att sammanslagning av prover från enskilda kor inte rekommenderas för testning på besättningsnivå.
    • Postpartum NEFAs: På besättningsnivå finns det en signifikant ökad risk för metaboliska och infektiösa sjukdomar efter kalvning, minskad mjölkproduktion eller minskad reproduktionsförmåga om >15-20 % av de testade korna efter kalvning har NEFA-värden > 0,70 mEq/L. Observera att som anges ovan rekommenderas inte poolning av prover från enskilda kor för testning på besättningsnivå.
• Hepatisk lipidos hos mjölkkor: I en studie hade en NEFA:kolesterolkvot >0,2 (SI-enheter) ett oddsförhållande på 9,9 för att ett djur skulle ha hepatisk lipidos (definierat som >10 % lipidinnehåll i levern), och detta gränsvärde var känsligare (63 % med 85 % specificitet) än BHB, enbart NEFA eller AST-aktivitet (>120 U/L) för att diagnostisera hepatisk lipidos (baserat på arean under den karakteristiska mottagarkurvan eller AUC). Djuren i denna studie hade dock blodmätningar gjorda vid olika tidpunkter efter laktationen (Mostafavi et al 2013).
• Negativ energibalans hos smådjur: Detta förekommer främst vid diabetes mellitus. I ett tillstånd av insulinbrist eller insulinresistens går inhiberingen av hormonkänsligt lipas förlorad. En regulatorisk obalans i den hormonkänsliga lipasaktiviteten ökar fettmobiliseringen från fettvävnad till levervävnad, vilket höjer koncentrationen av NEFAs.
• Negativ energibalans hos kameldjur: Sjuka, stressade kameldjur, särskilt dräktiga honor, löper risk att utveckla hepatisk lipidos. Mätning av NEFA kan göras för att avgöra om de befinner sig i negativ energibalans. Kameldjur med NEFA > 0,8 mEq/L (Tornquist et al 2001) löper ökad risk för lipidos. Anorexiska kameldjur har ofta en NEFA som är förhöjd men under detta värde och de kanske inte utvecklar lipidos.