Morpholino oligos är avancerade verktyg för att blockera platser på RNA för att hindra cellulära processer. En Morpholino-oligo binder specifikt till den valda målplatsen för att blockera cellkomponenternas tillgång till denna målplats. Denna egenskap kan utnyttjas för att blockera translation, splicing, miRNA eller deras mål och ribozymaktivitet.
Translationsblockering: Genom att steriskt blockera translationsinitieringskomplexet kan Morpholinos slå ner uttrycket av många målsekvenser helt och hållet, tillräckligt mycket för att efter att ha väntat på att det befintliga proteinet ska brytas ned, försvinner målproteinbandet från Western Blots. Till skillnad från många antisense-typer (t.ex. siRNA, fosforothioater) orsakar Morpholinos i allmänhet inte nedbrytning av sina RNA-målsekvenser; i stället blockerar de den biologiska aktiviteten hos mål-RNA:t tills RNA:t bryts ned på naturlig väg, vilket frigör Morpholino. Detta innebär att RT-PCR inte är lämpligt för att mäta translationsblockering av morfoliner.
Spliceblockering: Genom att blockera platser som är involverade i splicing av pre-mRNA kan Morpholinos användas för att modifiera och kontrollera normala splicinghändelser. Denna aktivitet kan lämpligen testas med RT-PCR, där framgångsrik spleppmodifiering visas som förändringar i RT-PCR-produktbandet på en elektroforesisk gel. Bandet kan förskjutas till en ny massa eller, om spleppmodifiering utlöser nonsense-medierad nedbrytning av transkriptet, kommer det vilda splicade bandet att förlora i intensitet eller försvinna.
Som alla reagens för nedsättning av gener måste Morpholinos aktivt levereras in i de flesta celler. Morpholinos kan levereras till odlade celler genom en rad olika metoder, inklusive skrapning av adherenta celler, elektroporation och till och med mikroinjektion. Vårt Endo-Porter-leveransreagens ger dock i allmänhet en utmärkt leverans i odlade celler när det gäller den mängd morfinoliner som levereras per cell, jämn fördelning i en cellpopulation, reproducerbarhet av leveransen och icke-toxicitet för de flesta celltyper vid den rekommenderade koncentrationen. Vid djurförsök kommer våra Vivo-Morpholinos med sin bifogade leveransdel in i celler från blodet efter i.v. administrering eller in i celler i vävnader som omger lokala injektioner. De är också de mest praktiska antisense-oligonerna för användning i cellkulturer eller explantationer, eftersom de inte kräver något ytterligare medel för cytosolisk leverans.
En Morpholino oligo skiljer sig radikalt från naturliga nukleinsyror, med metylenemorfolinringar som ersätter ribose- eller deoxyribose-sockerkomponenterna och icke-joniska fosforodiamidatlänkar som ersätter DNA:s och RNA:s anjoniska fosfater. Varje morfolinring placerar en av DNA:s standardbaser (A, C, G, T) på ett lämpligt sätt för parning, så att en 25-basig Morpholino-oligo starkt och specifikt binder till sin komplementära 25-basiga målplats i en RNA-sträng via Watson-Crick-parning. Eftersom Morpholino-oligons oladdade ryggrad inte känns igen av enzymer är den helt stabil mot nukleaser.
Vi uppmuntrar dig att använda ett mer exakt och kraftfullt verktyg för att lösa dina experimentella utmaningar. Ring vår kundsupportgrupp på doktorandnivå på Gene Tools för att komma igång med Morpholinos i dina studier. Telefon: (541) 929-7840 ext 1.
- Bedömning av leverans
- Löslighet och Morpholinos
Som med alla gen-nedslagningsmedel är effektiv leverans av Morpholinos avgörande. Även om det inte är avgörande att bekräfta leveransen vid experiment med embryonal mikroinjektion är det viktigt att bekräfta leveransen vid experiment med odlade celler. Vårt Endo-Porter-leveransreagens ger i allmänhet enkel och tillförlitlig leverans för de flesta celltyper. Du kan bedöma om du får en bra leverans till cytosolen i dina celler genom att använda ett fluorescerande märkt Morpholino. Vi rekommenderar att du använder vårt billiga fluoresceinmärkta standardkontrolloligo för detta ändamål.
När du använder ett fluorescerande Morpholino för att bekräfta leveransen, bör du börja med en koncentration på 10 microMolar Morpholino oligo i kulturmediet. Detta är en tillräckligt hög koncentration för att det fluorescerande märkta Morpholino efter 16 timmar ska vara synligt i cytosolen med hjälp av fluorescensmikroskopi. Ett inverterat fluorescensmikroskop är det bästa valet för att observera celler i odlingsplattor. Observera levande (ofixerade) celler. Använd ett torrt objektiv med högsta tillgängliga numeriska bländare för att samla in så mycket ljus som möjligt från cellerna. Framgångsrik leverans visar sig genom diffus fluorescens i hela cytosolen. Punkterad fluorescens indikerar vanligen att oligotypen är fångad i endosomerna, så ignorera punktformiga fläckar och leta efter den diffusa fluorescensen.
För faktiska experiment som levererar din egen sekvens Morpholino med Endo-Porter behöver du i allmänhet en koncentration på endast 1 till 5 mikromolär för att få en effektiv sterisk blockering av de flesta mRNA:er.
Tyvärr är Morpholino-oligon mycket mer lösliga än andra icke-joniska strukturella typer (t.ex. PNA), men vissa Morpholinos med hög G-innehåll (>30 %) har en begränsad löslighet. Dessutom minskar ibland fastsättningen av vår rödemitterande lissaminfluor oligonernas löslighet. Lösligheten varierar med oligosekvensen och är svår att förutsäga. Rekommendationerna nedan kan hjälpa till att upprätthålla oligoaktiviteten om din sekvens har dålig löslighet.
För långtidsförvaring förvaras dina Morpholino-stocklösningar bäst i lyofiliserad form, Det näst bästa valet är förvaring i lösning vid rumstemperatur. Att göra Morpholino-stocklösningar vid eller under 1 millimolär hjälper till att undvika löslighetsproblem. Vi rekommenderar lagring i rumstemperatur i tätt förslutna behållare och, för att undvika avdunstning i händelse av en felaktig förslutning av flaskan, är det klokt att förvara lagerlösningar i en fuktig miljö, t.ex. i en humidor (t.ex. en klockburk med en öppen bägare med vatten). Var försiktig så att oligon inte torkar ut, eftersom det kan vara svårt eller omöjligt att lösa upp en torkad oligon på nytt (även om frystorkade oligon löser sig ganska lätt). Det är bra att förvara flaskan i en mörk låda eller insvept i folie, eftersom fluormärkta oligos kan fotoblekas i ljus.
Aggregation i lösningen kan orsaka en minskning av den biologiska aktiviteten med tiden och detta kan inträffa i lösningar som förvaras i rumstemperatur. Detta kan i vissa fall vändas genom uppvärmning 5 min vid 65C eller i de flesta fall genom autoklavering (använd vätskecykeln). Oligonerna är mycket värmebeständiga och kan tolerera flera autoklaveringsomgångar utan nedbrytning. Ofta kan autoklavering återuppliva ett lager som har förlorat viss aktivitet på grund av aggregering av oligonerna.
DNA, RNA och de flesta reagenser för nedsättning av gener förvaras vanligtvis i ett isbad under experimenten för att minimera nedbrytning av nukleaser. Eftersom Morpholinos är helt resistenta mot enzymatisk nedbrytning och vattenlösningar är kemiskt stabila på obestämd tid (år) i rumstemperatur, rekommenderar vi att du under dina experiment förvarar dina lagerlösningar av Morpholinos i rumstemperatur. Om du kyler dina lagerlösningar i ett isbad riskerar du helt enkelt att Morpholino fälls ut.
Dessa försiktighetsåtgärder är mer än nödvändiga för de flesta sekvenser, men deras rutinmässiga användning bidrar till att undvika obehagliga överraskningar i händelse av att du stöter på en sekvens med låg löslighet.