Introduktion

4-hydroxy-l-prolin (hydroxiprolin) är en icke-proteinogen aminosyra som har en molekylvikt på 131,13 g/mol och syntetiseras genom posttranslationell hydroxylering av prolin under kollagenbiosyntesen (fig. 1). Vid undersökningar av fysiologisk och patologisk kollagenmetabolism används oftast mätningar av hydroxiprolin i plasma, urin och kroppsvävnad. Därför ger bestämning av hydroxiprolin användbar information för diagnos och prognos av sjukdomar som orsakas av störningar i kollagenmetabolismen (1). Sådana tillstånd är bl.a. hypertyreoidism, hyperparatyreoidism, akromegali, Pagets sjukdom, osteomalaci, rakitis, Marfans syndrom, osteogenesis imperfecta, sklerodaktyli, dermatomyosit och Cushings syndrom (2).

Fibros som uppstår i lever, lungor, njurar, hud och andra organ kan utvecklas till kronisk hepatit, leverskleros, levercancer, lungfibros och glomerulonefrit (3). Därför är det mycket viktigt att förebygga utvecklingen och minska svårighetsgraden av fibros hos patienter. Hydroxiprolin fungerar som en viktig diagnostisk indikator för fibrosens svårighetsgrad.

Mätning av hydroxiprolin i plasma, urin och kroppsvävnad är möjlig genom kolorimetriska metoder, högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och flödesinjektionsanalyser (4-6). Dessa metoder kräver dock stora provvolymer på grund av sin låga känslighet. Dessutom kräver HPLC en lång separationstid för varje prov. På senare år har vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) visat sig vara fördelaktigt på grund av sin höga känslighet och korta separationstid.LC-MS har använts för att mäta låga koncentrationer av droger i urin och urin med förorenade ämnen (7-9). Syftet med föreliggande studie var att tillämpa den nya LC-MS-metoden för att mäta hydroxiprolin. Som en indikator på fibros mättes hydroxyprolin i lever och lungor i en råttmodell av fibros med LC-MS och jämfördes med tidigare resultat som erhållits medHPLC- och kolorimetriska metoder.

Material och metoder

Etiskt uttalande

Studieprotokollet godkändes av den etiska kommittén vid Harbin Medical University (Harbin, Kina). Ett standardförfarande för att erhålla skriftligt informerat samtycke ingick i protokollet och godkändes av den etiska kommittén vid Harbin Medical University.

Reagens

Dimetylnitrosamin (DMN) och hydroxiprolin erhölls från Nacalai Tesque Inc. (Kyoto, Japan). Nembutal köptes från Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Osaka, Japan) ochbleomycin erhölls från Nihon Kayaku Inc. (Tokyo, Japan). Alla andra kemikalier var av reagenskvalitet.

Förberedelse av en modell för lung- och leverfibros hos råttor

En modell för lungfibros skapades hos fem veckor gamla Wistar-råttor genom injektion av bleomycin (BLM, 0,30U/100 g, i.P.) i luftstrupen under nembutal (50 mg/kg) bedövning.Friska råttor injicerades med 0,9 % saltlösning (kontroll).

En modell av leverfibros skapades hos sju veckor gamla Wistar-råttor genom en enda injektion av DMN (40 mg/kg, i.p.). Normala friska råttor var kontrollerna och injicerades med0,9 % saltlösning (kontroll). Förberedelsen av lungfibrosmodellen och av insamlingsvävnaden baserades på de metoder som beskrivs i tidigare studier (10,11).

Mätning av hydroxiprolin i en råttmodell av lungfibros med en kolorimetrisk metod

Den vänstra lungan avlägsnades, vägdes (~0.3 g) och homogeniserades i 5 % triklorättiksyralösning (x10 volym) med hjälp av en cellhomogenisator (Eilard, Berlin, Tyskland) vid 8 000 × g (4 °C) i 2 minuter i ett isbad. Cellerna centrifugerades (2 500 × g, 4 °C) i 20 minuter och supernatanten tvättades två gånger med destillerat vatten. Därefter tillsattes 6 N HCl vid 110 °C helt och hållet i början och reagerade i 16 timmar. Efter avslutad reaktion tillsattes toluen (3 ml) och blandningen omrördes i 20 minuter. Efter centrifugering (3 000 × g, 20 °C) i 10 minuter samlades det organiska skiktet upp och p-dimetylaminobenzaldehyd tillsattes.Hydroxiprolin i provet påvisades med hjälp av en multiplattspektrometer (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) vid 560 nm.

Mätning av hydroxiprolin i lever med HPLC

Vänsterlungan avlägsnades, vägdes (~0,3 g) och homogeniserades i 5 ml etanol med hjälp av en cellhomogenisator (Eilard) vid 8000 × g (4 °C) i 2 minuter i ett isbad. Homogenatet centrifugerades (2 500 × g, 4 °C) i 20 minuter och supernatanten samlades upp. Vätskan (1 ml) erhölls och värmdes i 8 timmar vid 60 °C tills den är torr. Efter att ha löst upp restprodukten i 40 μl etanol och 80 μl boratbuffert (0,1 M, pH 8) tillsattes 40 μl4-fluor-7-nitrobenzofurazan (100 mM) som fluorescerande medel. Reaktionen fick fortsätta vid rumstemperatur i 15 timmar i mörker. Därefter tillsattes 840 μl saltsyra (6 mol/l) för att avsluta reaktionen. Efter centrifugering (2 500 × g, 20 °C) i 20 minuter avlägsnades supernatanten för HPLC-analys.

Ett Hitachi L6000 HPLC-system (Hitachi High-Technologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA) användes.Detektion utfördes med en Hitachi L7480 fluorescensspektrometer (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japan; excitation vid 475 nm, emission vid 530 nm). Kolonnen (HitachiHigh-Technologies Corporation) var en YMC Pack ODS-AQ (150×6,0 mmID) vid rumstemperatur. Den mobila fasen var acetonitril: vatten(35:65-50:50 gradient under 15 min) och flödeshastigheten var 1 ml/min.

Mätning av hydroxiprolin ipulmonell och leverorganisation med LC-MS

Den vänstra lungan avlägsnades, vägdes (~0.3 g) och homogeniserades i 5 % triklorättiksyralösning (x10 volym) med hjälp av en cellhomogenisator (Eilard) vid 8 000 × g (4 °C) i 2 minuter i ett isbad. Cellerna centrifugerades (2 500 × g, 4 °C) i 20 minuter. Den överstående vätskan tvättades två gånger med destillerat vatten. Därefter tillsattes 6 N HCl vid 110 °C i 16 timmar och proverna förbereddes för mätning. Levern avlägsnades, vägdes (~0,3 g) och homogeniserades i 5 ml etanol med hjälp av en cellhomogenisator (Eilard) vid 8 000 × g (4 °C) i 2 minuter i ett isbad. Homogenatet centrifugerades (2 500 × g, 4 °C) i 20 minuter, supernatanten samlades upp och proverna förbereddes för mätning.

Koncentrationen av hydroxiprolin bestämdes enligt en LC-MS-metod med hjälp av ett LC-MS2020-system (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). När det gäller LC var den rörliga fasen 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4. Kolonnen var Shin-pack VP-ODS (150×2 mm i diameter). Flödeshastigheten var 0,2 ml/min. När det gäller MS användes atmosfärisk kemisk jonisering (APCI). Positiv jondetektion användes också. Probelektronspänningen var 4,5 kV och sondens ström var 4,2 μA. Temperaturen för APCI-sonden var 250 °C och elektronspänningen för den krökta desolvationslinjen (CDL) var -30,0 V. CDL-temperaturen var 250 °C och blocktemperaturen 20 °C. Förspänningen för Q-array 1, 2 och 3 var 5,0, 25,0 respektive 35,0 V. Q-array RF-elektronspänningen var 150,0 V.

Statistisk analys

Underskotten mellan grupperna undersöktes genom envägsvariansanalys. Om ingen signifikant skillnad konstaterades undersöktes skillnaden mellan grupperna med Bonferroni-metoden. Korrelationer undersöktes med hjälp av ett tvåsidigt test. P<0,05 ansågs indikera en statistiskt signifikant skillnad.

Resultat

Mätning av hydroxiprolinkoncentrationen med hjälp av LC-MS

MS-kromatogram för hydroxiprolin

Massaspektrumet för hydroxiprolin visas i fig. 2. MS av hydroxiprolinstandard (80 pg/ml) resulterade i fragmenttoppar med en molekylmassa på 173,0 (molekyljon + ättiksyra-vatten) som genererades från addition till ättiksyra-ammonium för att öka antalet jonmolekyler (molekylkvantitet, 131,15) och jonstyrka.

LC-MS-kromatogram av hydroxiprolin

LC-förhållandena var som följer: Mobilfas, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; kolonn,Shin-pack VP-ODS (150×2 mm diameter); flödeshastighet, 0,2 ml/min och ultraviolett (UV) detektion vid 230 nm. MS utfördes med hjälp avAPCI-joniseringsmetoden och jondetektionen var positiv.

Kromatogrammet för LC-MS-selected ion monitoring (SIM) av hydroxiprolin (m/z, 173,0) presenteras i figur 3. Såsom observerats för hydroxiprolinstandard observerades en topp vid 1 ng/ml med en retentionstid på 2,213 minuter. En skarp topp observerades också vid 50 ng/ml. Vid 1 μg/ml, vilket var 1 000 gånger standardkoncentrationen, noterades en liten topp i LC-UV-spektrumet (230 nm).

Känslighet för LC-MS-detektion av hydroxyprolin

LC-MS-SIM-standardkurvan för hydroxyprolin (m/z, 173,0; molekylärjon + ättiksyra-vatten) visas i fig. 4. Med hjälp av topparealmetoden för standardkurvan uppvisade hydroxiprolin en skarp topp vid 35 ng/ml (fig. 3). Vid koncentrationer <35 ng/ml observerades dock ingen korrelation mellan topparna. Från 35-560 ng/ml observerades en korrelation mellan topparna och standardkurvan var en rak linje. Vid 60 och 80 μg/ml var topparna nästan identiska. En korrelation mellan topparna observerades inte vid koncentrationer >60 μg/ml.

LC-MS-kromatogram och MS-spektrum av hydroxyprolin i en modell av lung- och leverfibros hos råttor

Fig. 5 visarLC-MS-kromatogram och MS-spektrum med SIM-detektion av hydroxyprolin (m/z 173,0; molekylärjon + ättiksyra-vatten) i en modell av fibros i lungorna hos råttor. I LC-MSch-kromatogrammet från lungan observerades en distinkt topp vid m/z 173,0 vid en uppehållstid på 2,213 minuter, som liknar den för hydroxiprolinstandard. Hydroxiprolin identifierades med atm/z 131,15 i masspektrumet.

Fig. 6 illustrerar LC-MS-kromatogrammet och MS-spektrumet med SIM-detektion av hydroxiprolin (m/z 173,0; molekylärjon + ättiksyra-vatten) i fibrotisk levervävnad från råttor. Liksom för hydroxiprolinstandarden noterades en topp vid en retentionstid på 2,213 minuter i LC-MS-kromatogrammet och MS-spektrumet.

Hydroxiprolinkoncentrationen i lungvävnad (kolorimetriska metoder och LC-MS-metoder)

Figur 7 visar en jämförelse mellan de kolorimetriska metoder och LC-MS-metoder som används för att bestämma hydroxiprolinkoncentrationen i råttors lungvävnad.Varje kolumn representerar medelvärdet ± standardavvikelsen av nio experiment. Enligt den kolorimetriska metoden var hydroxyprolinkoncentrationen i råttans lungvävnad i den BLM-infunderade gruppen (652,3±70,0 μg/vänster lunga) signifikant högre jämfört med kontrollgruppen (547,1±52,3 μg/vänster lunga; P<0,05). Enligt LC-MS-metoden hade den BLM-infunderade gruppen(610,9±50,3 μg/vänster lunga) ett signifikant högre värde jämfört med kontrollgruppen (493,3±53,5 μg/vänster lunga; P<0,05).Hydroxiprolinkoncentrationen i lungvävnad från råttor mätt med LC-MS-metoden hade dock ett lägre värde jämfört med den som mättes med den kolorimetriska metoden.

Hydroxiprolinkoncentrationerna i lungvävnad från råttor mätt med kolorimetriska metoder och LC-MS-metoder jämförs i fig. 8. En korrelation mellan de kolorimetriska metoderna och LC-MS-metoderna för bestämning av hydroxyprolinkoncentrationen i lungvävnaden i kontrollgruppen identifierades (r=0,972). På samma sätt identifierades en korrelation mellan de kolorimetriska metoderna och LC-MS-metoderna för bestämning av hydroxyprolinkoncentrationen i lungvävnaden hos den BLM-infunderade gruppen (r=0,918).

Hydroxyprolinkoncentrationen i råttans levervävnad genom fluorescensmärkning och LC-MS-metoder

Bedömningen av hydroxyprolinkoncentrationen i råttans levervävnad genom fluorescensmärkning och LC-MS-metoder illustreras i fig. 9. Enligt fluorescensmärkningsmetoden var hydroxiprolinkoncentrationen i råttlevervävnad i den DMN-infunderade gruppen (105,4±36,5 μg/g) betydligt högre jämfört med den i kontrollgruppen (30,3±2,7 μg/g; P<0,05). Även enligtLC-MS-analysen uppvisade den DMN-infunderade gruppen (190,4±70,3 μg/g)ett signifikant högre värde jämfört med kontrollgruppen (62,4±6,8 μg/g; P<0,05). Hydroxiprolinkoncentrationen i råttlevervävnad mätt med LC-MS var dock högre jämfört med den som uppmättes med fluorescensmärkningsmetoden.

Hydroxiprolinkoncentrationen i råttlevervävnad bedömd med fluorescensmärknings- och LC-MS-metoderna korrelerar i fig. 10. Hydroxiprolinkoncentrationen i levervävnad i kontrollgruppen som bedömdes med fluorescensmärkning korrelerade med den som erhölls med LC-MS-metoden (r=0,957). Hydroxiprolinkoncentrationen i levervävnaden i den DMN-infunderade gruppen som beräknades med fluorescensmärkningsmetoden korrelerade också med den som beräknades med LC-MS-metoden (r=0,981).

Diskussion

Hydroxiprolin är en typ av aminosyra som finns i albumen. Prolinresterna i proteinet hydroxyleras av4-monooxgenas för att generera 4-hydroxi-2-oxoglutalsyra, som omvandlas till alanin och glycin via 4-glutaminsyra i människokroppen. I varje inre organ i kroppen kan inflammation och fibrosism ge upphov till ackumulering av komponenter i den extracellulära matrisen (ECM) (12), men under patologiska förhållanden kan ytterligare fibros uppstå i lever, lungor och njurar (13,14).Kronisk hepatit och leverskleros är förknippade med fibros och har också ett nära samband med levercancer (15).

I lungorna är fibrosens svårighetsgrad beroende av typen av lunginflammation (16).Vanligtvis åtföljs lungfibros av interstitiell lunginflammation (17). Fibros i inre organ orsakas av proliferation av ECM-komponenter som deponeras av myofibroblaster. För att förstå utvecklingen av fibros krävs en undersökning av kollagenkoncentrationen. Hydroxiprolinkoncentrationen är kopplad till kollagen som en indikator på fibrosens omfattning (18-20). Hydroxiprolin är viktigt som ett index för sjukdomar som orsakas av kollagenproliferation (som infibros) och metabolismfel.

Under de senaste åren har LC-MS visat sig vara en mycket känslig detektionsmetod (7,8,21).LC-MS består av en LC- och en MS-komponent och det gränssnitt som förbinder dem. LC-delen är identisk med konventionell HPLC. Provet joniseras av gränssnittsdelen. Termosprayjonisering gav upphov till instabila (flyktiga) produkter, varför APCI användes (som joniserar materialet, men inte lösningsmedlet, efter nebulisering med lösningsmedel under atmosfäriskt tryck). Elektrosprayjonisering (ESI)kan användas för att jonisera molekyler med hög polaritet och hög molekylvikt, vilket är idealiskt lämpat för gränssnittskomponenten. i den aktuella studien var ESI dock inte anpassat för temamätning av hydroxyprolin i kroppsprover, eftersom ESI inte åtföljdes av termospray vid jonisering. Det var ett enklare förfarande att mäta hydroxiprolin i kombination med Na+ genom att tillsätta ytterligare Na+ till provet.

MS-spektrumet av hydroxiprolin uppvisade toppar med m/z 173,0 och 131,15. m/z 173,0 identifierades som den topp som representerar ättiksyra-saltet från ättiksyra-ammonium som tillsattes till den rörliga fasen för att öka den joniska styrkan. Eftersom m/z 131.15 och 173.0 är ungefär lika starka i MS-spektrumet, valdes jonen m/z 173.0 av SIM i MS-kromatogrammet för att undvika störande topp från den rörliga fasen.

I MS-kromatogrammet för hydroxiprolinstandard vid 1 ng/ml observerades en topp i SIM-mätningen med m/z 173.0. I UV-spektrumet (230 nm) av hydroxyprolin vid 1 μg/ml, vilket var 1 000× standardkoncentrationen, observerades en liten topp (mätningen utfördes samtidigt som LC-mätningen).

Vid koncentrationer <35 ng/ml observerades ingen stark korrelation mellan de olika metoderna bland topparna, och det var inte möjligt att skapa en standardkurva. Man antog att analyten kan ha påverkats av den mobila fasens topp, eftersom hydroxiprolin har en jämförelsevis låg molekylvikt (131,15). Dessutom kan toppens retentionstid ha blivit instabil på grund av lösningsmedlets polaritet vid låga koncentrationer (hydroxiprolinkoncentration <35 ng/ml).

Hypotesen var att det kan vara möjligt att mäta koncentrationer av ämnen som är så låga som pg/ml-nivån. För toppen av hydroxyprolin i MS-kromatogrammet var retentionstiden kort (2,213 min). Den relativa jonstyrkan i MS-spektrumet vid m/z 131,15 och 173,0 var ungefär identisk, och följaktligen valde den mobila fasens interferenstopp en jon med m/z 173,0. I LC-MS-kromatogrammet för hydroxiprolin i lungor och levervävnad observerades en skarp topp med m/z 173,0 vid en uppehållstid på 2,213 minuter, precis som för hydroxiprolinstandard. När det gäller MS-spektrumet bekräftades hydroxiprolinets molekyljontopp (m/z 131,15).

Mätning av hydroxiprolinkoncentrationen i lung- och levervävnad med hjälp av LC-MS jämfördes med den som erhållits med hjälp av den kolorimetriska metoden samt en fluorescensmetod med HPLC från en tidigare studie av vår grupp. En mycket signifikant positiv korrelation noterades. Värdet för hydroxiprolinkoncentrationen i lungan som erhölls med den kolorimetriska metoden var dock högre än det värde som erhölls med LC-MS. Dessutom var hydroxiprolinkoncentrationen i levern som erhölls med fluorescensmetoden med hjälp av HPLC lägre jämfört med det värde som erhölls med LC-MS (vilket skulle vara en hög absorbans av alla komponenter i provet vid en konstant våglängd på 560 nm).

Sammanfattningsvis mättes hydroxiprolin, som en indikator på fibros, med kolorimetriska metoder och HPLC-metoder i tidigare studier av vår grupp. Vid en jämförelse visade den aktuella studien att LC-MS-metoden var mer fördelaktig och kännetecknades av en enkel process, hög känslighet (pg-nivå) och kort separationstid. Ytterligare undersökningar med större provstorlekar är motiverade för att bekräfta dessa resultat.

Acknowledgements

Författarna är tacksamma mot M. Kusunose, M. Ono ochA. Hamada (Department of Pharmacy, Kochi Medical School, Kochi,Japan) för att ha tillhandahållit flera reagenser som använts i denna studie, hjälpsamma förslag och teknisk expertis. Detta arbete har finansierats av det offentliga hälsodepartementet i provinsen Heilongjiang (nr 2013365) i Kina.

	Kitchener RL och Grunden AM: Prolidasefunktion i prolinmetabolismen och dess medicinska och biotekniska tillämpningar. J Appl Microbiol. 113:233-247. 2012. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Myllyharju J: Prolyl 4-hydroxylases, keyenzymes in the synthesis of collagens and regulation of theresponse to hypoxia, and their roles as treatment targets. Ann Med.40:402-417. 2008. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wick G, Grundtman C, Mayerl C, et al: Theimmunology of fibrosis. Annu Rev Immunol. 31:107-135. 2013.Visa artikel : Google Scholar
	Hofman K, Hall B, Cleaver H and MarshallS: High-throughput quantification of hydroxyproline foretermination of collagen. Anal Biochem. 417:289-291. 2011.Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	McAnulty RJ: Methods for measuringhydroxyproline and estimating in vivo rates of collagen synthesisand degradation. Methods Mol Med. 117:189-207. 2005.PubMed/NCBI
	McCooeye M and Mester Z: Comparison offlow injection analysis electrospray mass spectrometry and tandemass spectrometry and electrospray high-field asymmetric waveformion mobility mass spectrometry and tandem mass spectrometry for thedetermination of underivatized amino acids. Rapid Commun MassSpectrom. 20:1801-1808. 2006. Visa artikel : Google Scholar
	Jemal M and Xia YQ: LC-MS Developmentstrategies for quantitative bioanalysis. Curr Drug Metab.7:491-502. 2006. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chen G and Pramanik BN: LC-MS for proteincharacterization: current capabilities and future trends. ExpertRev Proteomics. 5:435-444. 2008. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Becker S, Kortz L, Helmschrodt C, et al: LC-MS-based metabolomics in the clinical laboratory. J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci. 883-884:68-75. 2012.
	Cui T, Kusunose M, Hamada A, et al:Relationship between the eosinophilia of bronchoalveolar lavagefluid (BALF) and the severity of pulmonary fibrosis induced bybleomycin in rats. Biol Pharm Bull. 26:959-963. 2003. Visa artikel : Google Scholar
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, Hamada A, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosisin dimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Maruyama K: Hydroxproline. Nihon Rinsho.62(Suppl 12): 220-223. 2004.(På japanska).
	Muiznieks LD and Keeley FW: Molecularassembly and mechanical properties of the extracellular matrix: Afibrösa proteinperspektiv. Biochim Biophys Acta. 1832:866-875.2013. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lu P, Takai K, Weaver VM and Werb Z:Extracellular matrix degradation and remodeling in development anddisease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3:a0050582011.PubMed/NCBI
	Pungpapong S, Kim WR och Poterucha JJ:Natural history of hepatitis B virus infection: an update forclinicians. Mayo Clin Proc. 82:967-975. 2007. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Strieter RM and Mehrad B: New mechanismsof pulmonary fibrosis. Chest. 136:1364-1370. 2009. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Swigris JJ och Brown KK: Acuteinterstitial pneumonia and acute exacerbations of idiopathicpulmonary fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 27:659-267. 2006.Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effekter av Sho-saiko-to extrakt på leverfibros i relation till förändringarna i hydroxyprolin- och retinoidnivåer i levern hos råttor. J Pharm Pharmacol. 51:1079-1084. 1999. Visa artikel : Google Scholar
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on HGF and TGF-beta levels ofintraorgans in liver-injured rats after partial hepatectomy. JPharm Pharmacol. 52:111-118. 2000. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, et al: Effect ofSho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosis indimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holčapek M, Jirásko R and Lísa M: Recentdevelopments in liquid chromatography-mass spectrometry and relatedtechniques. J Chromatogr A. 1259:3-15. 2012.