Vi använde glukos-, glukos- och glutamin-näringskällor för att tyda kolflödet i K562-cellerna och förändringarna som reaktion på BaP-behandling. Sammantaget observerar vi den största mängden etikettinkorporering i riboseenheter och laktat (se och Additional file 1: Figur S1 för detaljer om etikettfördelningar). Såsom illustreras i figur 1 kan märkningsinkorporering i Krebscykeln från glukos förväntas ge två tydligt olika märkningsmönster av metaboliter i Krebscykeln beroende på om C2-fragmentet kommer in via pyruvatkarboxylas (PC) eller pyruvatdehydrogenas (PDH). Det pyruvat som bildas från glukos kommer att ge glutamat via PDH, men glutamat via PC-aktivitet. Eftersom PC-aktiviteten producerar oxaloacetat från pyruvat förväntar man sig malat som härrör från PC, medan PDH-produkten kommer att vara malat eller malat.

NMR-spektra visar att stora mängder aspartat och malat är PC-avledda

Som framgår av fig. 2 observeras signifikanta skillnader mellan celler som bearbetar glukos i 3 vs. 24 timmar för resonanserna av malat och aspartat. Dessa skillnader manifesterar sig främst i en förändring av NMR-kopplingskonstanter. Storleken på dessa kopplingskonstanter beror på karaktären hos den intilliggande kolatomen: en karboxylsyregrupp ger en mycket större kopplingskonstant än en CH2-grupp. Kopplingskonstanten för 13C1 13C2-gruppen i aspartat eller malat är cirka 50-60 Hz medan kopplingskonstanten för en 13C2 13C3-grupp är cirka 35-40 Hz.

För en 24 timmars märkningsperiod visar fig. 2 skenbara kopplingskonstanter på 53 Hz för C2 hos malat och aspartat. Denna stora skenbara kopplingskonstant visar att kopplingen av C2 med den intilliggande C1-karboxylsugruppen dominerar. Detta 13C1 13C2-kopplingsmönster (och även 13C3 13C4, se Additional file 1) beror på PDH-aktiviteten och möjligen även på metaboliter som passerar flera gånger genom Krebscykeln under en längre märkningsperiod.

För den korta märkningsperioden på 3 timmar observeras de mindre skenbara kopplingskonstanterna 47 och 41 Hz för C2 (Fig. 2 och Additional file 1: Figur S1), vilket indikerar att kopplingen till den angränsande metylen C3 dominerar. Förekomsten av 13C2 13C3-delen vid kortare märkningsperioder visar att den produkt som härrör från PC-aktiviteten dominerar vid kortare märkningsperioder.

Det bör noteras att de observerade signaluppdelningarna inte representerar de exakta skalära kopplingskonstanterna i en blandning av märkta föreningar. Ändå ger den observerade förändringen en tydlig indikation på högre mängder av PC-produkten vid kortare märkningsperioder i både malat och aspartat.

Framtida bevis för PC-aktivitet i subspektra av uracil

I de novo pyrimidinsyntesen bildas uracil från aspartat via karbamoyl-aspartat, orotat och dihydroorotat. Därför bör märkningsmönster i aspartat återspeglas i pyrimidinringens signaler. Ytterligare fil 2: Figur S2 visar förväntade inbyggnader av etiketter för uracil. När uracilbasen i UDP syntetiseras från aspartat är 13C:s destination följande: C1, C2 och C3 i aspartat blir C10, C11 respektive C12 i UDP medan C4 försvinner (se tilläggsfil 2). I HSQC-spektra är det endast C11 och C12 som kan observeras direkt, eftersom C10 inte har någon proton kopplad till sig.

För glukosmärkta prover kommer det PC-avledda aspartatet att vara C2C3-märkt. Detta omvandlas till ett märkt C11C12-fragment i UDP. PDH-avledd aspartat kan dock märkas vid C1C2 eller C3C4. Detta omvandlas till C10C11 respektive ett isolerat C12 i uracil. Spektra av C12 indikerar därför relativa mängder PC- respektive PDH-aktivitet; PC ger en doublet för C12, medan PDH ger en singlet vid C12.

Alla spektra visade både singlet- och doublet-signaler vid C12 (fig. 3). Intensiteten av doubletten i förhållande till singletten förändrades dock mellan 3 och 24 timmars data med en faktor tre, vilket återigen tyder på en förskjutning från PC- till PDH-medierad märkning med tiden. Den bild som framträder från flera metaboliter är att det finns en parallell aktivitet hos både PC och PDH, men PC-produkten kanaliseras främst till produkter som är direkt kopplade till oxaloacetat, vilket ger den höga observerade mängden PC-produkt i dessa metaboliter vid en kortvarig exponering. Endast vid längre märkningsperioder observeras PDH-produkten i den vänstra grenen av Krebscykeln.

BaP-inducerat malonat härrör från nedströms PC-aktivitet i K562-celler

Vi har visat att malonat kan bildas från oxaloacetat genom kemisk omvandling under påverkan av väteperoxid och föreslog i vår tidigare studie att malonatackumulering som svar på BaP-behandling drevs av behandlingsinducerad förhöjning av ROS som verkar på oxaloacetat . Proverna spikades med malonat för att bekräfta vår tilldelning av malonatmetylen-1H/13C-resonanserna i HSQC-spektra (se tilläggsfilerna 3 och 4). I den här studien har vårt spårämnesbaserade tillvägagångssätt gjort det möjligt för oss att överväga ursprunget till det observerade malonatet.

Som visas i fig. 4a skulle ROS-avledd malonat som härrör från oxaloacetat som hade bildats direkt från pyruvat genom PC-aktivitet med glukos som näringskälla förväntas vara märkt i positionerna C1 och C2. I den alternativa situationen att PDH-aktivitet omvandlar pyruvat till acetyl-coA vid inträde i Krebscykeln, skulle ROS-medierad omvandling av den resulterande oxaloacetat till malonat förväntas ge upphov till två produkter med etikett i C1-positionen eller i C1- och C2-positionen i ett 1:1-förhållande, eftersom Krebscykeln passerar genom symmetriskt succinat och fumarat (se även fig. 1).

Figur 4b visar en representativ 1D-skiva från HSQC-spektra som härrör från 24 timmars BaP-behandlade glukosmärkta celler och visar tydligt den läkemedelsinducerade genereringen av en stark malonatsignal. I motsvarande HSQC-spektra från 24 timmars BaP-behandlade glukosmärkta celler observerade vi en tydlig dublett (fig. 4c visas som röda toppar) med en uppdelning på 58 Hz, vilket tyder på en märkt CH2-grupp kopplad till ett karboxylsyrakol. Detta är en tydlig indikation på en C1,C2 (eller C2,C3)-märkt malonat med märkning i endast en av de två karboxylsyregrupperna. Malonat som är märkt i alla tre positionerna och som kan uppstå vid flera genomgångar av Krebscykeln skulle förväntas visa en triplett vid C2 i 13C-dimensionen av HSQC-spektra, eftersom åtminstone en viss procentandel skulle vara märkt i båda COO-grupperna (AX2-kopplingsmönster). Avsaknaden av en central signal i HSQC är därför en stark indikation på att malonat härrör från PC-aktivitet uppströms. Frånvaron av malonat som härrör från flera Krebscykler och PDH-aktivitet stöds också av det faktum att malonat som härrör från 24 timmars märkning av BaP-behandlade celler med glukos endast uppvisade en singel (Fig. 4c visas som blå topp).

För att ytterligare bevisa att läkemedelsinducerat malonat härrör nedströms från PC-aktivitet, skaffade vi 13C-1D-spektra där vi kunde observera COO-resonanserna av malonat direkt (Fig. 4d). Ett referensspektrum av 10 mM malonsyra i samma buffert (pH 7) som användes för celextrakt bekräftade frekvensen av COO-resonansen (fig. 4d).

PC-medierad märkning förväntas ge en dublett vid C1 (som härrör från malonat), medan PDH-medierad märkning förväntas ge en 50:50-blandning av en dublett som härrör från malonat och en singel som härrör från malonat (fig. 4a). Även om de erhållna spektren var brusiga även efter 24 timmars registrering, visade de en tydlig dubblering utan någon restsignal i mitten (fig. 4d), vilket bekräftar att den PC-avledda märkningsprodukten är dominerande. Av detta drar vi slutsatsen att malonat verkligen härrör från ROS-medierad omvandling av oxaloacetat som helt eller åtminstone till övervägande del härrör från PC-aktiviteten och inte visar något bidrag från en eventuell PDH-produkt, inte ens efter en märkningsperiod på 24 timmar. Kontrollförsök med glutamin som kolkälla visade endast minimal inbyggnad av märkningen i malonat. Det malonat som produceras från glukos visade sig huvudsakligen märkas via PC. Tillsammans tyder dessa två fakta starkt på att malonat huvudsakligen produceras från glukos via glykolys och PC-medierat inträde av pyruvat i TCA-cykeln.

Bevis på parallell PDH-aktivitet

Tabell 1 jämför 1 J CC-kopplingskonstanter och multiplet-intensitetsmönster som ses i de 3 och 24 timmars märkta dataseten. I både 3 och 24 h datasetet är märkningen vid glutamats C4 mycket större än märkningen vid C4 och den uppdelning som ses vid C4 tyder på koppling till C5. Detta tyder starkt på att PDH-medierad märkning är dominerande för glutamat vid båda tidpunkterna. Citratets C2 delas av en stor koppling till C1, vilket återigen starkt tyder på att PDH-medierad märkning är dominerande. Dessa märkningsmönster tyder på en klar dominans av PDH-produkter för den högra grenen av Krebscykeln, som leder från citrat till glutamat.

Beräkningsteknisk multipletanalys

Snitt från 1H-13C-HSQC analyserades också kvantitativt genom att simulera 13C-NMR-spektra för en blandning av olika isotopomerer med hjälp av programvaran pyGamma från programvaran NMRLab . För glutamat bekräftade multipletanalysen att PDH-medierad märkning var dominerande både vid 3 och 24 timmar oavsett BaP-behandling. För aspartat bekräftade multipletanalysen att det skedde en förskjutning från PC-medierad märkning vid 3 timmar till PDH-medierad märkning vid 24 timmar. De simulerade spektrumen visas i Additional file 5: Figur S4, och tabell 2 bekräftar de kvalitativa resultaten för aspartat och glutamat.