Bakteriestammar och tillväxtförhållanden

Bakteriestammar anges i den kompletterande tabellen 2. Escherichia coli odlades på Luria Broth (LB)-plattor eller i flytande LB-medium, kompletterat med 200 µg ml-1 erytromycin vid 37 °C. Transformation av E. coli med plasmid-DNA utfördes med hjälp av kemiskt kompetenta celler. S. pneumoniae serotyp 2 D39 och serotyp 4 TIGR4 och deras isogena mutanter odlades på Columbia blodagarplattor (Oxoid) som innehöll erytromycin (5 µg ml-1) och/eller kloramfenikol (5 µg ml-1), eller odlades i Todd-Hewitt-buljong kompletterad med 0,5 % jästextrakt (THY; Roth) respektive kemiskt definierat medium (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences). Odling av pneumokocker på blodagar eller i flytande kulturer utfördes vid 37 °C och 5 % CO2 utan omrörning.

Mutantkonstruktion

För konstruktionen av pneumokocktacL-mutanter i D39 och TIGR4 användes ett DNA-fragment bestående av S. pneumoniae D39 spd_1672-genen och dess upp- och nedströms flankerande regioner amplifierades genom PCR från genomiskt DNA med hjälp av primerna SPD1672_OLup_for och SPD1672_OLdwn_rev (primerna anges i den kompletterande tabellen 2). De renade PCR-produkterna klonades i pUC18 och E. coli DH5α kemiskt kompetenta celler transformerades med den resulterande plasmiden. Den rekombinanta plasmiden pNH1 med den önskade DNA-insatsen renades och användes som mall för en invers PCR-reaktion med primerna InvrevKpnISPD1672 och InvforPstISPD1672. Den borttagna gensekvensen ersattes av en ermB-gen som amplifierades genom PCR från vektor pTP1 med hjälp av primerna InvrevKpnIErm och InforPstIErm. Den slutliga rekombinanta plasmiden användes för att transformera och mutagenisera pneumokocker. Transformationseffektiviteten utvärderades med hjälp av den slutliga rekombinanta plasmiden jämfört med en annan plasmid för borttagning av gener (för borttagning av cbpL-genen) i S. pneumoniae D39Δcps 44. Det är anmärkningsvärt att transformationseffektiviteten därmed ökade betydligt för tacL-deletionen (2,8 kolonier per ng plasmid för cbpL jämfört med 29,8 kolonier per ng plasmid för tacL).

Isogena mutanter kompletterades med ett pBAV1CpE-baserat in trans-system. pBAV1CpE modifierades från pBAV1K-T5-gfp45 genom att byta ut kanamycinresistensgenen mot en kloramfenikolresistensgen och T5-promotorn mot en erytromycinpromotorregion (pE), som innehåller ribosombindningsstället och startkoden. Den fullständiga spd_1672-genen amplifierades genom PCR med hjälp av primerna 1672_com_for och Spd1672_com_rev och det renade fragmentet klonades in i pBAV1CpE. Den resulterande plasmiden pBAV-tacL användes för att transformera isogena tacL-mutanter. Deletionen av tacL samt in trans-komplementeringen verifierades med hjälp av qRT-PCR (kompletterande figur 3).

Kvantitativ PCR i realtid (qRT-PCR)

Inkapslad och icke-inkapslad D39 vildtypstam, tacL-bristande mutant och kompletterad mutant odlades i THY fram till mitten av logfasen (A 600 = 0,35-0,45) och skördades för RNA-isolering med hjälp av EURx GeneMatrix Universal RNA purification kit (roboklon). RNA-kvaliteten kontrollerades genom agarosgelelektrofores och standard-PCR med hjälp av primerna EnoRT_F och EnoRT_R (se kompletterande tabell 2). Syntesen av cDNA utfördes med SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher) och hexameric_random primers (GE Healthcare) enligt tillverkarens anvisningar. Kvaliteten på cDNA kontrollerades genom PCR med hjälp av primerna EnoRT_F och EnoRT_R och koncentrationen mättes med nanodrop. cDNA förvarades vid -20 °C fram till vidare tester. För qRT-PCR-experimenten användes StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) och SYBR® Green Master Mix (Biorad) i kombination med tacL-specifika primers samt enolase-primers som kontroll (se kompletterande tabell 2). Programvaran StepOne (v. 2.3, Life Technologies) användes för dataanalys. De slutliga resultaten presenteras som fluorescensens storlek (ΔRn) plottat mot PCR-cykelnummer.

Sekvensering och bioinformatisk analys

Sekvensering: 1 ng renat kromosomalt DNA från S. pneumoniae stammarna D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), och TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) användes för att förbereda enskilda bibliotek med hjälp av och enligt Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kit. En Agilent Technology 2100 Bioanalyzer användes för att verifiera taggningen och den slutliga fragmentstorleksfördelningen i biblioteket på ett högkänsligt DNA-chip. AMPure XP-pärlor användes för rening av DNA-bibliotek. Det slutliga poolade biblioteket applicerades på ett MiSeq Reagent v3 600cycle kit och sekvenserades på ett MiSeq-system som en 300-cykelkörning med parade ändar. Den slutliga bibliotekspoolen spikades med 5 % PhiX-kontrollbibliotek. En klustertäthet på 847 ± 25 (K mm-2) uppnåddes med 96,46 ± 1,48 % av klustren som klarade filterspecifikationerna. 20,3 miljoner läsningar (94,7 %) av 21,1 miljoner totala läsningar klarade filterspecifikationerna, vilket ledde till 12,52 Gbp sekvensdata. Indexavläsningarna var jämnt fördelade över de sex enskilda proverna. De genererade FASTQ-filerna genomgick ytterligare bioinformatisk analys enligt nedan.

SNP-detektion och annotering: SNP-detektion gjordes för S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL individuellt med hjälp av ”snippy” (https://github.com/tseemann/snippy; parameter: minsta andel för variantbevis: 60 %; minsta täckning av variantplatsen: ≥5 sekvenser läsningar). Som referensgenom användes Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) eller Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3).

De resulterande SNP:erna för varje mutantgrupp (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) och (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) slogs samman och jämfördes. Genomtäckningen uppskattades med qualimap46 med hjälp av samma referensgenom som för SNP-detektering.

Isolering av pneumokockteikosyror

Extraktion och isolering av LTA: LTA-reningen utfördes i princip som beskrivet på annat håll7 , men för att optimera utbytet av pnLTA har en specifik detalj ändrats. Pneumokockceller resuspenderades i citratbuffert (50 mM, pH 4,7) och sönderdelades tre gånger med fransk press (Constant Cell Disruption System, Serial No. 1020) vid 10 °C och ett tryck på 20 kPSI. SDS tillsattes till en slutkoncentration på 4 % till de kombinerade supernatanterna. Lösningen inkuberades i 30 minuter vid 100 °C och omrördes därefter över natten i rumstemperatur. Lösningen centrifugerades vid 30 000×g i 15 minuter vid 4 °C. Pelleten tvättades fyra gånger med citratbuffert med samma centrifugeringsförhållanden som ovan. De kombinerade LTA-innehållande supernatanterna och det resulterande sedimentet, som innehåller det råa PGN-WTA-komplexet, lyofiliserades separat. De resulterande fasta ämnena tvättades båda fem gånger med etanol (centrifugering: 20 minuter, 20 °C, 10 650×g) för att avlägsna SDS och ljödofiliserades (vilket ledde till pellet A som innehöll LTA och pellet B som innehöll PGN-WTA-komplexet). För att isolera LTA, resuspenderades pellet A i citratbuffert och extraherades med en lika stor volym butan-1-ol (Merck) vid rumstemperatur under kraftig omrörning. Faserna separerades genom centrifugering vid 2 100×g i 15 minuter vid 4 °C. Den vattenhaltiga fasen (som innehåller LTA) samlades upp och extraktionsförfarandet upprepades två gånger med den organiska fasen plus interfasen. De kombinerade vattenfaserna ljofiliserades och dialyserades därefter i 5 dagar vid 4 °C mot 50 mM ammoniumacetatbuffert (pH 4,7; 3,5 kDa cutoff-membran); bufferten byttes ut var 24:e timme. Den råa LTA som uppstod renades ytterligare med hjälp av hydrofob interaktionskromatografi (HIC) som utfördes på en HiPrep Octyl-Sepharosekolonn (GE Healthcare; 16 × 100 mm, bäddvolym 20 ml). Det råa LTA-materialet löstes upp i så lite startbuffert (15 % propan-1-ol (Roth) i 0,1 M ammoniumacetat (pH 4,7)) som möjligt och centrifugerades vid 13 000×g i 5 minuter i rumstemperatur och den resulterande supernatanten lyofiliserades. Den LTA-innehållande pelletsen löstes upp i HIC-startbufferten i en koncentration av 30 mg ml-1 och renades genom HIC med hjälp av en linjär gradient från 15 till 60 % propan-1-ol (Roth) i 0,1 M ammoniumacetat (pH 4,7). LTA-innehållande fraktioner identifierades genom ett fotometriskt fosfatprov47. De fosfatinnehållande fraktionerna kombinerades, lyofiliserades och tvättades med vatten vid frystorkning för att avlägsna kvarvarande buffert.

Extraktion och isolering av WTA: Isolering och extraktion av WTA utfördes som beskrivet på annat håll11 , men med mindre ändringar. Pellet B (innehållande det råa PGN-WTA-komplexet), som uppstod vid isolering av LTA, resuspenderades i en koncentration av 10 mg ml-1 i 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) innehållande 20 mM MgSO4. DNas A och RNas I tillsattes till slutkoncentrationer på 10 respektive 50 µg ml-1. Suspensionen rördes under 2 timmar vid 37 °C. Därefter tillsattes 10 mM CaCl2 och trypsin (100 µg ml-1) och omrörningen fortsatte över natten vid 37 °C. SDS med en slutkoncentration på 1 % tillsattes och blandningen inkuberades i 15 minuter vid 80 °C för att inaktivera enzymerna. Cellväggen återställdes genom centrifugering i 45 minuter vid 130 000×g vid 25 °C. Den resulterande pelletsen återuppslöts i 0,8 ml 8 M LiCl per 1 ml ursprungligen använd Tris-HCl-lösning och inkuberades i 15 minuter vid 37 °C. Efter ytterligare en centrifugering under samma förhållanden som ovan återupptas pelletsen i 1 ml 10 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA, pH 7,0) per ml av den först använda Tris-HCl-lösningen och detta prov inkuberas vid 37 °C i 15 minuter. Pelleten tvättades två gånger med vatten. Slutligen återuppslöts pelletsen i 2-4 ml vatten och lyofiliserades, varvid det renade PGN-WTA-komplexet erhölls. Beroende på den specifika forskningsfrågan utfördes därefter ytterligare kemiska eller enzymatiska behandlingar.

Kemiska och enzymatiska behandlingar

Hydrazinbehandling av LTA: Renad LTA löstes i en koncentration på 5 µg µl-1 i vattenfritt hydrazin (N2H4; ICN Biomedicals) innan den inkuberades i 1 timma vid 37 °C under omrörning. Reaktionen släcktes genom att samma volym aceton tillsattes och torkades under en ström av kväve; torkningssteget upprepades två gånger. Därefter renades den råa de-O-acylerade LTA genom gelpermeationskromatografi (GPC) på en Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; kolonnstorlek: 1,5 × 120 cm; buffert:

Enzymatisk nedbrytning av PGN-WTA-komplexet: För att avlägsna alla aminosyror från PGN löstes PGN-WTA-komplexet i 50 mM Tris-HCl (pH 7,0; 10 mg ml-1) och behandlades med pneumokocker LytA-amidas enligt annan beskrivning11. Rekombinant His-märkt LytA-amidas (10 µg LytA per mg) tillsattes i tre alikvots efter 0, 24 och 48 timmar för en total inkubationsperiod på 72 timmar vid 37 °C. Därefter inaktiverades enzymet genom kokning i 5 minuter vid 100 °C. Efter centrifugering (25 000×g, 15 min, 20 °C) samlades supernatanten upp och lödofiliserades. Det råa LytA-behandlade PGN-WTA-komplexet renades ytterligare genom GPC på en Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; kolonnstorlek: 1,5 × 120 cm; buffert: 150 mM ammoniumacetat (pH 4,7)). Det erhållna materialet med hög molekylvikt (~12 mg) smältes ytterligare med lysozym (200 µg; Sigma) och mutanolysin (200 µg; Sigma) i en 800 µl reaktionsblandning innehållande natriumfosfat (20 mM; pH 4,8) och natriumazid (0,02 %) vid 37 °C över natten. Enzymerna inaktiverades genom uppvärmning vid 100 °C i 5 minuter. Det lösliga materialet återfanns genom centrifugering (18 000×g, 10 min, 20 °C) och lyofiliserades. Isolering av pnWTA bundet till små PGN-fragment uppnåddes genom en slutlig GPC med de villkor som nämns ovan.

NMR-spektroskopi

NMR-spektroskopiska mätningar utfördes i D2O vid 300 K på en Bruker AvanceIII 700 MHz (utrustad med en inverterad 5 mm fyrdubbelresonans Z-grad cryoprobe). Deutererade lösningsmedel köptes från Deutero GmbH (Kastellaun, Tyskland). Aceton användes som extern standard för att kalibrera 1H (δH 2,225) och 13C (δC 30,89) NMR-spektra. 31P NMR-spektra (δP 0,0) kalibrerades med 85 % fosforsyra i D2O som extern standard. 1H NMR-uppgifter bekräftades genom tvådimensionella 1H-, 1H COSY- och TOCSY-experiment, och 13C NMR-uppgifter angavs genom tvådimensionell 1H, 13C HSQC, baserat på 1H NMR-uppgifter. Interresidual konnektivitet och ytterligare bevis för 13C-tilldelningen erhölls genom tvådimensionella 1H, 13C HMBC- och 1H, 13C HSQC-TOCSY-experiment. Fosfatgruppernas konnektivitet tilldelades genom tvådimensionell 1H, 31P HMQC och 1H, 31P HMQC-TOCSY. Alla data förvärvades och bearbetades med Bruker TOPSIN V 3.0 eller högre.

Masspektrometri

För att analysera pnWTA bundet till små PGN-fragment utfördes elektrosprayjonisering fouriertransform joncyklotronresonansmasspektrometri (ESI-FT-ICR-MS) på ett 7 Tesla APEX Qe-instrument (Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland) med negativt jonläge och en blandning av vatten/propan-2-ol/7 M trietylamin/ättiksyra (50:50:0.06:0,02 v/v/v/v/v/v) som lösningsmedel, enligt tidigare beskrivning6. MS-analys av hydrazinbehandlad LTA gjordes på en Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bremen, Tyskland) i negativt jonläge med samma lösningsmedel. En Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, USA) jonkälla användes med en sprutspänning inställd på -1,1 kV. Massskalan kalibrerades externt med glykolipider med känd struktur, och alla spektrum var laddningsdekonvoluterade. De angivna masstalen hänvisar till de neutrala molekylernas monoisotopiska massa.

Elektronmikroskopi

Fältemissionsskanningelektronmikroskopi: Bakterier fixerades i tillväxtmediet med 5 % formaldehyd och 2,5 % glutaraldehyd i 1 timma på is och tvättades med HEPES-buffert (HEPES 0,1 M, 0,09 M sackaros, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9). En alikvot på 50 µl av den fixerade bakterielösningen placerades på poly-l-lysinbelagda täckglas och fick sätta sig i 10 minuter. Efter fixering med 2 % glutaraldehyd i PBS i 5 minuter i rumstemperatur tvättades täckglasen med TE-buffert (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9) innan de torkades i en graderad serie aceton (10, 30, 50, 70, 90 och 100 %) på is i 10 minuter för varje steg. Proverna i steget med 100 % aceton fick nå rumstemperatur innan ytterligare ett byte i 100 % aceton skedde före kritisk punkttorkning med flytande CO2 (CPD 30, Balzers, Liechtenstein). De torkade proverna täcktes med en palladium-guldfilm genom sputterbeläggning (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) innan de undersöktes i ett fältemissionsröntgenelektronmikroskop Zeiss Merlin (Oberkochen, Tyskland) med hjälp av HESE2 Everhart Thornley SE-detektorn och SE-detektorn i linsen i förhållandet 25:75 vid en accelerationsspänning på 5 kV.

Transmissionselektronmikroskopi: Bakterierna fixerades enligt ovan och fixerades ytterligare med osmiumtetroxid (1 % i HEPES-buffert) i 1 timme i rumstemperatur. Efter tvättning med HEPES-buffert torkades proverna med 10, 30 och 50 % aceton på is innan de inkuberades i 70 % aceton med 2 % uranylacetat över natten vid 7 °C. Proverna dehydratiserades ytterligare med 90 och 100 % aceton på is, fick nå rumstemperatur och dehydratiserades ytterligare med 100 % aceton, varefter de byttes till 100 % etanol. Därefter infiltrerades proverna med det aromatiska akrylhartset LRWhite. Efter polymerisering i 2 dagar vid 50 °C skars ultratunna snitt med en diamantkniv, samlades på butvarbelagda 3000 mesh-galler och kontrafärgades med 4 % vattenbaserad uranylacetat i 3 minuter. Proverna avbildades i en Zeiss TEM 910 vid en accelerationsspänning på 80 kV och vid kalibrerade förstoringar.

Kontrast och ljusstyrka justerades med Adobe Photoshop CS3.

Generering av antikroppar

Polyklonala antikroppar mot analyserade CBP:er uppföddes i möss med hjälp av rutinmässiga immuniseringsprotokoll. Kortfattat immuniserades CD-1-möss intraperitonealt med 20 µg rekombinant protein och Freunds ofullständiga adjuvans (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) (50:50 v/v). Vid dag 14 och 28 fick mössen en boost med 20 µg protein och Freunds ofullständiga adjuvans (50:50 v/v). Mössen avblodades vid dag 42 och polyklonalt IgG renades från serum med hjälp av protein A-Sepharose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland). Antikroppar anges i kompletterande tabell 2.

Flödecytometri

S. pneumoniae D39 vildtyp, dess isogena tacL-mutant och den kompletterade mutanten odlades i THY-medium till mitten av logfasen, skördades vid 3 275×g i 6 minuter och tvättades med PBS (pH 7,4). För kvantifiering av kapselinnehållet inkuberades en 100 µl suspension innehållande 4 × 108 bakterier med antikapselpolysackaridantisera (SSI Type serum 2, Statens Serum Institute) (1:500 i PBS) i 30-45 minuter vid 37 °C och 5 % CO2 i 96-hålsplattor (U-botten, Greiner Bio-One). Efter tvättning inkuberades proverna med en sekundär antikropp av get-antiklabb-IgG-kopplad Alexa488-märkt antikropp (Invitrogen) (1:500 i PBS, 30-45 min, 37 °C). Efter tvättning med PBS fixerades bakterierna med 1 % formaldehyd över natten vid 4 °C.

Förekomsten av CBPs samt mängden teikosyror i icke inkapslade D39 vildtyp-, mutant- och kompletterade D39-stammar mättes med flödescytometri efter fixering med 1 % formaldehyd i 1 timme vid 4 °C. Tvåhundra µl suspensioner innehållande 8 × 108 bakterier inkuberades med specifika polyklonala antikroppar mot olika CBP (1:500 i PBS), eller för kvantifiering av TAs med antikroppar mot P-Cho (TEPC-15) eller Forssman-antigen (15 minuter vid 37 °C och 5 % CO2) i 96-hålsplattor (U-botten, Greiner Bio-One). Efter tvättning inkuberades proverna med en sekundär get-anti-IgG-kopplad Alexa488-märkt antikropp (Invitrogen) (15 min, 37 °C). Fluorescensen bestämdes med en FACS Calibur™ (BD Biosciences).

Immunoblot-analys

S. pneumoniae D39, dess isogena tacL-mutant och den kompletterade mutanten odlades i THY-medium tills en A 600 på 0,35-0,45 uppnåddes, skördades genom centrifugering vid 3270×g vid 4 °C i 6 minuter och resuspenderades i 1 ml PBS-buffert vid pH 7,4. Totalt 2 × 108 celler per brunn fylldes på och kördes på 12 % SDS-PAGE innan de överfördes till ett nitrocellulosemembran genom semidry blotting. Membranen blockerades i 2 timmar i rumstemperatur med 5 % skummjölk (Roth) och Tris-buffrad saltlösning (TBS; pH 7,4) och inkuberades över natten vid 4 °C med muspolyklonala antikroppar mot olika CBP (1:500 i 5 % skummjölk + TBS 0,01 % Tween (T-TBS)). En kaninpolyklonal antikropp mot enolas (1:25 000 i 5 % skummjölk + T-TBS) användes som laddningskontroll. Membranen tvättades med T-TBS, CBPs detekterades med den sekundära fluorescensmärkta IRDye® 800CW. Get α-mus IgG och enolas påvisades med fluorescensmärkt IRDye® 680RD. Antikropp av get α-kanin-IgG påvisades genom inkubation med lämplig antikropp (1:15 000 i 5 % skummjölk i T-TBS) i 45 minuter i mörker i rumstemperatur; membranen tvättades med T-TBS och slutligen en gång med TBS. Skanningen av membranen utfördes med en Odyssey® CLx (LI-COR) skanner.

Triton X-100-inducerad autolysanalys

S. pneumoniae D39 vildtyp, mutant och kompletterad stam odlades i THY-medium till mitten av logfasen, skördades vid 3275×g i 6 minuter och tvättades med PBS (pH 7,4). En 1 ml suspension innehållande 1 × 109 bakterier inkuberades med en slutlig koncentration av 0,01 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) och inkuberades vid 37 °C. Lysis av bakterieceller övervakades genom att mäta absorbansen vid 600 nm vid fördefinierade tidpunkter.

Epitelial adherence assay

Pneumokockers adherens till epitelceller analyserades med humana A549-celler (ATCC® CCl-185TM) enligt beskrivningen48. Kortfattat: Konfluenta epitelceller, odlade på täckglas (Hartenstein; i 24-hålsplattor, ~1 × 105 celler per brunn) inokulerades med 5 × 106 mitt-exponentiellt odlade pneumokocker och inkuberades i infektionsmedium (DMEM (HyClone™) + 1 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS)) vid 37 °C och 5 % CO2. Därefter tvättades cellerna tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning innehållande 1 % FBS (Gibco) för att avlägsna obundna bakterier. Därefter fixerades bakterierna med PBS innehållande 1 % paraformaldehyd (PFA, Roth).

Immunofluorescensmikroskopi

Fixerade pneumokocker, bundna till A549-celler, tvättades tre gånger med PBS och blockerades i 1 timme i rumstemperatur med PBS + 10 % FBS. Efter tvättning inkuberades proverna i 1 timme i rumstemperatur med en polyklonal antikropp (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) mot pneumokocker (framställd i kanin mot värmeinaktiverad S. pneumoniae TIGR4 och D39). Som sekundär antikropp användes fluorescensmärkt Alexa-Fluor488 get-antikantikropp mot kanin (Abcam) (1:500, 1 timme, rumstemperatur). Bakterieadhärensen övervakades för minst 20 celler per klass täckglas med hjälp av fluorescensmikroskopi. Varje experiment upprepades tre gånger i två exemplar. Alla data rapporteras som medelvärden ± s.d. Statistisk analys utfördes med hjälp av det opartade tvåsidiga Student’s t-testet. I alla analyser ansågs ett p-värde på <0,05 vara statistiskt signifikant.

Fagocytosförsök

Antibiotikaskyddsanalys: Ett konfluent skikt av monocytära THP-1-celler (ATCC® TIB-202TM) som odlats i 24-hålsplattor (3 × 105 celler per brunn i RPMI-1640 (HyClone™) kompletterat med 10 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS, Gibco)) differentierades till fagocyter genom tillsats av 200 nmol ml-1 phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA, Sigma-Aldrich) och inkuberades i 48 timmar vid 37 °C och 5 % CO2. Därefter tvättades THP-1-cellerna med RPMI-1640 kompletterat med 10 % värmeinaktiverad FBS och inkuberades i ytterligare 24 timmar vid 37 °C och 5 % CO2. Före infektion odlades pneumokocker i THY till mitten av logfasen (A 600 = 0,35-0,45), centrifugerades och tvättades med infektionsmedium (RPMI-1640 kompletterat med 1 % värmeaktiverat FBS). THP-1-celler tvättades och infekterades med pneumokocker i 500 µl infektionsmedium. Infektionen synkroniserades genom centrifugering (2 min, 300×g) för att initiera en samtidig kontakt mellan bakterier och fagocyter. Därefter inkuberades cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 under olika tidsperioder. Efter infektionen tvättades cellerna med infektionsmedium och inkuberades med penicillin G (100 enheter ml-1, Sigma-Aldrich) och gentamicin (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) i 1 timme vid 37 °C och 5 % CO2 för att döda extracellulära bakterier. Därefter tvättades och lyserades fagocyterna med 1 % saponin (Sigma-Aldrich) för att frigöra intracellulära pneumokocker. Kolonibildande enheter (cfu) av intracellulära bakterier bestämdes genom utläggning av bakterier i lämpliga utspädningar på blodagarplattor (Oxoid)49. Tidsberoende avdödning av intracellulära pneumokocker utvärderades genom avdödning av extracellulära pneumokocker med hjälp av antibiotika enligt beskrivningen ovan. Därefter inkuberades fagocyterna ytterligare i infektionsmedium under olika tidsperioder (0-3 timmar). Intracellulära bakterie-cfu övervakades enligt beskrivningen ovan. Alla experiment upprepades fyra gånger som dubbletter. Data normaliserades i antibiotikaskyddsanalyserna till infektionsmultipliciteten (MOI) eller i den tidsberoende avdödningen till återvunna bakterier vid tidpunkt 0 h. Alla analyser analyser gjordes med hjälp av envägs ANOVA med Bonferroni-korrigering.

Dubbel immunofluorescensfärgning och mikroskopi

PMA-differentierade THP-1-celler (3 × 105 celler per brunn) odlades på sterila täckglas (12 mm, Hartenstein) och infekterades med pneumokocker enligt ovan. Efter infektionen tvättades THP-1-cellerna med infektionsmedium och fixerades med 4 % paraformaldehyd (Roth) över natten vid 4 °C. Glaslockglas tvättades med PBS och blockerades med PBS + 10 % värmeinaktiverad FBS i 1 h. Efter tvättning färgades extracellulära bakterier med hjälp av ett polyklonalt α-pneumokocker-IgG (1:500) och ett Alexa-Fluor488-märkt sekundärt get α-kanin-IgG (1:500, Abcam) i 30 minuter i rumstemperatur. Glaslockglas tvättades tre gånger med PBS efter permeabilisering av THP-1-celler med 0,1 % Triton X-100 i PBS (10 min, rumstemperatur). Efter tvättning färgades intracellulära pneumokocker med hjälp av ett polyklonalt α-pneumokocker-IgG (1:500) och ett sekundärt Alexa-Fluor568-märkt get α-kanin-IgG (1:500, Abcam) i 30 min i rumstemperatur. Experimenten upprepades tre gånger som dubbletter. För statistisk analys analyserades 50 celler per glaslock för antalet intracellulära bakterier. Data normaliserades till MOI. Alla analyser analyserades med hjälp av envägs ANOVA med Bonferroni-korrigering. I alla analyser ansågs ett p-värde på <0,05 vara statistiskt signifikant.

Cellinjer

Alla cellinjer som användes i den här studien köptes från ATCC (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202) och har testats för att vara mykoplasma-negativa genom PCR och skanningselektronmikroskopi.

Akut muspneumoni och systemisk infektionsmodell

Åtta till tio veckor gamla kvinnliga CD-1-möss (outbred, Charles River, Sulzfeld, Tyskland) infekterades intranasalt med bioluminescerande pneumokocker enligt den senaste beskrivningen50. Kortfattat odlades pneumokocker till mitten av den exponentiella fasen (A 600 = 0,35) i THY-medium som innehöll 10 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum. Efter centrifugering justerades infektionsdosen (20 µl) till ~2,5 × 107 cfu i PBS (pH 7,4). För infektion i näsan sövdes mössen genom intraperitoneal injektion av ketamin/xylazin (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Tyskland; Rompun, Provet AG, Lyssach, Tyskland), och bakterierna administrerades droppvis i näsborrarna. Infektionsdosens cfu bekräftades genom utläggning av serieutspädningar av inokulumet på blodagarplattor. Man övervakade musens överlevnad och tog bilder av bioluminescens med förvalda intervaller med hjälp av IVIS® Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA). För den systemiska infektionsmodellen administrerades en infektionsdos på 3 × 103 cfu intraperitonealt i en volym på 200 µl PBS (pH 7,4). Alla djurförsök utfördes i enlighet med de tyska bestämmelserna från Society for Laboratory Animal Science (GV-SOLAS) och den europeiska hälsolagen från Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Alla försök godkändes av Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Tyskland, tillstånd nr 7221.3-1-056/16-1).

Datatillgänglighet

Råa FASTQ-filer som innehåller genomsekvensdata från S. pneumoniae skickades in till EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) och lagrades i Short Read Archive (SRA) under studiens anslutningsnummer RJEB18558. Alla andra relevanta data som stöder studiens resultat finns tillgängliga i denna artikel och dess kompletterande informationsfiler, eller från motsvarande författare på begäran.