2.2 Produktionsstrategier för Levan

Levan syntetiseras som en exopolysackarid (EPS) i den extracellulära matrisen hos bakterier från olika släkten, såsom Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus och Zymomonas (Sarilmiser et al, 2015). Utöver dessa extremofila levanproducenter rapporterade Poli et al. (2009) Halomonas sp. som en levanproducent. Ytterligare studier om den potentiella användningen av Halomonas levan som ett bioflockulerande medel (Sam et al., 2011), peptid- och proteinbaserat läkemedelsleveranssystem (Sezer et al., 2011, 2015), biokompatibel tunna (Sima et al., 2011, 2014), vidhäftande flerskiktsfilm (Costa et al., 2013) och en heparinimiterande glykan (Erginer et al., 2016) undersöktes. Fig. 12.2 visar den allmänna produktionsprocessen för mikrobiell levan.

Figur 12.2. Grundläggande steg i efterföljande produktionsled för levan.

Mikrobiella EPS produceras vanligen i aeroba, nedsänkta fermenteringssystem. Fermenteringsförhållanden, t.ex. luftning, omrörning, pH, koncentration av löst syre, temperatur, mediumsammansättning och bioreaktorns utformning kan avgöra produktens egenskaper och produktionsavkastningen. För att uppnå en hög produktionskvalitet och avkastning måste därför en genomarbetad optimering av dessa parametrar utföras för varje organism (Öner et al., 2016). Till exempel undersökte Srikanth et al. (2015) effekterna av fermenteringsparametrar inklusive initialt pH, levantillskott, sackaroskoncentration, kvävekälla, inokulumkoncentration och odlingstid på levan-syntesen med Acetobacter xylinum NCIM2526 som producentstam. Optimala förhållanden fastställdes till 10, 50-60 och 1,49 g/L för kväve, sackaros respektive inokulum. Levanavkastningen ökade märkbart efter de första 24 timmarna och den maximala levanproduktiviteten uppnåddes efter 122 timmar när det ursprungliga pH-värdet sattes till 6,8. En ökning av det ursprungliga levantillskottet från 0,1 till 0,4 g/L ökade levanavkastningen från 1,22 till 1,65 g/L. Allt över 0,4 g/L gav ingen ytterligare ökning av avkastningen. Inokulumkoncentrationer mellan 5 % (v/v) och 10 % (v/v) resulterade i en förändring av levanavkastningen som förväntat och en maximal avkastning (1,46 g/L) uppnåddes vid 7 % (v/v). Sackaroskoncentrationer från 20 till 80 g/L påverkade avkastningen av levan. I intervallet 40-50 g/L ökade produktionsavkastningen, i intervallet 70-80 g/L minskade den och i intervallet 20-40 g/L förändrades den inte.

Sarilmiser et al. (2015) studerade levanproduktion i en halofil mikroorganism (Halomonas smyrnensis AAD6T) med hjälp av olika stimulerande faktorer. Till exempel tillämpades olika utfodringsstrategier med olika tidsintervall i ett batch-bioreaktorsystem, och flera initiala förhållanden testades i skakkulturer. Bland de olika pH- och sackaroskoncentrationer som testades uppnåddes maximalt levanutbyte vid pH 7 (1,345 g/L levan) och 50 g/L sackaros (1,320 g/L levan). När kväve- och fosforbegränsningar tillämpades minskade både levankoncentrationen och biomassan medan Yp/x-värdena ökade. Kvävepulsstrategier minskade levan-syntesen på grund av den förlängda tillväxtperioden, sackarospulsstrategier förbättrade celltillväxten och levan-produktionen avsevärt, och NaCl-pulsen hade ingen inverkan på tillväxten. Intressant nog producerade kulturer som odlades i närvaro av borsyra de högsta koncentrationerna av levan (8,84 g/L) under kontrollerade bioreaktorförhållanden. Denna förbättring förklarades av det biologiska fenomenet känt som quorum sensing (QS), där boratomer är involverade; en av de signalmolekyler som är involverade i QS i H. smyrnensis AAD6T identifierades senare som en C16-acylhomoserinelakton (Abbamondi et al., 2016).

Molekylvikten hos levan är en avgörande faktor för dess användbarhet i olika industrier, inklusive livsmedels-, kosmetika- och medicinska industrier (Belghith et al., 1996). Att bestämma de optimerade förhållandena för levanproduktion är avgörande för att erhålla den önskade molekylviktsföreningen (Porras-Domínguez et al., 2015). Till exempel utvärderade Wu et al. (2013) subtila ändringar i produktionsprocessen för att erhålla olika molekylvikter av levan i batch- och fed-batch-system, med Bacillus subtilis (natto) Takahashi som producentstam. När höga (400 g/L) och låga (20 g/L) koncentrationer av sackaros tillämpades erhölls lägre respektive högre molekylvikt av levan. Detta linjära förhållande tillskrevs effekten av sackaros på levansucraseenzymet. Författarna drog slutsatsen att levans molekylvikt var beroende av reaktionsförhållandena, såsom pH, temperatur, omrörningshastighet och sackaros, där den sistnämnda var den mest effektiva faktorn som bestämde levans molekylvikt.

Levanproduktion i immobiliserade cellsystem är också fördelaktigt eftersom sådana system gynnas av relativt enkla processer i efterföljande led, hög volymmässig produktivitet, avancerad processtyrning och minskad kontamineringsrisk vid EPS-produktion (Ürküt et al., 2007). Implementering av denna gynnsamma metod för levanproduktion kan användas ett alternativ till batch-, fed-batch- och kontinuerliga processer (Öner et al., 2016). Silbir et al. (2014) testade till exempel levanproduktion i batch- och kontinuerliga fermenteringssystem med Zymomonas mobilis B-14023. Kontinuerliga fermentationsproduktioner kördes i en bioreaktor med packad bädd som använde Ca-alginatimmobiliserade celler. Inkubationstid, initialt pH och substratkoncentration var de tre mest betydelsefulla processvariablerna för produktion av levan i batch-systemet. Den högsta mängden levan (40,2 g/L) producerades när jästextrakt användes som organisk kvävekälla i shake-flask-kulturer. Dessutom användes immobiliserade Z. mobilis-celler i det kontinuerliga fermenteringssystemet framgångsrikt för levanproduktion. Okontrollerbara tryckfall i systemet och sönderdelning av Ca-alginatgelpärlor var de största begränsningarna för längre fermenteringstider.

Trots mångfalden av levanproducerande mikroorganismer förblir produktionskostnaderna för levanpolysackarid höga. Detta är förmodligen den största flaskhalsen för dess kommersialisering (Öner et al., 2016; Sarilmiser et al., 2015). Fermenteringsmedier utgör ungefär 50 % av produktionskostnaderna för en mikrobiell process (Van Hoek et al., 2003), men billiga kolkällor som sirap och melass har tidigare använts för mikrobiell levanproduktion (Özcan och Öner, 2015). Kucukasik et al. (2011) undersökte sockerbetsmelass och stärkelsemelass som sackarosersättning i Halomonas-kulturer. Klarering, pH, svavelsyra, trikalciumfosfat och förbehandling med aktivt kol användes i olika kombinationer för att justera den kemiska tillgängligheten för levanproduktion. Slutsatsen var att den högsta avkastningen av levan uppnåddes vid en TCPHAC-koncentration på 10 g/L, dvs. 4,19 respektive 3,68 g/L. När man använde 30 g/L TCPHAC och HAC uppnåddes en levanavkastning på 7,56 och 4,44 g/L. Att avlägsna tungmetaller och öka järnkoncentrationen resulterade i en minskning av cellintegriteten och levanavkastningen i den här studien. I andra studier har svartstrapssockerrörsmelass i Bacillus lentus V8-kulturer (Abou-Taleb et al., 2015), dadelsirap i Mycobacterium levaniformis 1406-kulturer (Moosavi-Nasab et al, 2010), sockerbetsmelass i Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475-kulturer (Han och Watson, 1992) samt sockerrörsmelass och -sirap i Z. mobilis ATCC 31821-kulturer (De Oliveira et al, 2007) undersöktes som billiga kolkällor för levanproduktion.

Levanbiosyntes i fermenteringssystem under vatten begränsas av kravet på celltillväxt som kanske inte uppfyller de optimala villkoren för hög levansucraseaktivitet (Santos-Moriano et al., 2015). Cellfria system tar dock bort denna begränsning och ger ytterligare fördelar, såsom enkel förberedelse, återanvändbarhet och kontroll av förändringar i mikromiljön (Jang et al., 2001). Av denna anledning är det avgörande att erbjuda en optimal miljö för levansucrase. Till exempel undersökte Lu et al. (2014) inflytandet av olika faktorer, såsom substratkoncentration, reaktionstid, temperatur och pH, på levanproduktion med hjälp av rekombinant levansucrase i ett cellfritt system. De observerade en maximal avkastning av levan (7,1 g/L) med 0,8 M sackaros, pH 6,5 och 40 °C i 24 timmar. Avkastningen av levan ökade parallellt med en ökning av sackaroskoncentrationen från 0 till 0,8 M. Deras studie visade att det rekombinanta enzymet uppvisar liknande biokemiska egenskaper som det naturliga enzymet.