Biologiska analyser av Bradykinin och besläktade kininer
Kininer är potenta hypotensiva medel i alla studerade djurarter (54). Det vanligaste in vivo-testet för dessa peptider är blodtrycket hos råttor, som beskrivits tidigare. Vasodilaterande effekter av kininer mäts i isolerade perfunderade organ med intakt endotel, enligt det förfarande som beskrivs i avsnitt IV. Kininernas relaxerande effekt i arteriella kärl utvärderas in vitro i hundens halspulsåder (57) med den metod som beskrivs av Regoli och Barabé (34). Den venokonstriktoriska effekten mäts in vitro i kaninens jugularvena (42) enligt det förfarande som sammanfattas nedan.
Venerna, tagna från kaniner (1,0-2,0 kg), skärs i spiralformade remsor som är 2 mm breda och 2 cm långa och suspenderas i Krebs-lösning (syresatt vid 37°C) som innehåller en inhibitor av konverterande enzymer (Captopril, 10 μM) för att förhindra nedbrytning av kinin (34). Vävnadens sammandragningar som svar på kininer registreras enligt tidigare beskrivning och fullständiga koncentrations-responskurvor mäts vanligen för att utvärdera affiniteterna hos kininer och deras antagonister. Kaninens jugularvena har visat sig innehålla en B2-receptorsubtyp (B2A) (tabell V).
Det vanligaste icke-kärlpreparatet är ileum från marsvin, som tas från marsvin på 250-350 g och prepareras som en längsgående remsa av glatt muskulatur, enligt Rang (37). Vävnaden suspenderas in vitro i Krebs-lösning (syresatt vid 37 °C) och dess spänningsförändringar mäts på samma sätt som beskrivs ovan för de isolerade kärlen (se avsnitt I). Me marsvinets ileum är det preparat som används för att karakterisera B2B-receptorsubtypen (tabell V).
B1-receptorer studeras med hjälp av en remsa från kaninens aorta, som förbereds och hanteras på samma sätt som för angiotensin. Vävnaden är nästan okänslig för kininer, särskilt för desArg9BK, Bt-receptoragonisten, i början av experimentet. Vävnadens känslighet ökar under flera timmars (upp till 6-10 timmar) inkubation eftersom B1-receptorer bildas de novo (55). Kininernas kontraktila effekter registreras och analyseras med samma instrument och tillvägagångssätt som beskrivs i avsnitt I för angiotensin. Kaninvävnader kan sensibiliseras för desArg9BK genom att djuren förbehandlas med lipopolysackarid (LPS), som injiceras intravenöst 5 timmar innan djuret avlivas (56). Mekanismen för generering av B1-receptorer genom LPS har undersökts (60, 61). Aortor och andra vävnader som tagits från LPS-behandlade kaniner reagerar på desArg9BK från början av inkuberingen in vitro (56). På samma sätt uttrycker hundens njurartärer B1-receptorer spontant och visar hög känslighet för desArg9BK (62).
Flera föreningar har använts för att karakterisera kininreceptorer i isolerade organ, med hjälp av de biologiska svaren (kontraktilt) från tre preparat (tabell V). Bradykininer och kallidin är potenta stimulanter i kaninens jugularvena (RJV) och marsvinsileum (GPI), medan desArg9BK och Lys,desArg9BK är inaktiva. Den motsatta potensordningen observeras i kaninens aorta (RA). desArg9BK är en antagonist endast på RA. På dessa grunder föreslog Regoli och Barabé (54) hypotesen om två kininreceptorer, B1 (RA) och B2 (RJV, GPI och många andra preparat och tester) som till en början karakteriserades endast med agonister (54) och som senare (se nedan) har karakteriserats med antagonister. B2-receptorantagonister identifierades av Vavrek och Stewart (63) och förbättrades därefter av olika forskare (64-66) genom att ersätta Pro3 med hydroxiprolin (Hyp), genom att lägga till en d-Arg till N-terminus, genom att ersätta Phe8 med Leu och genom att ersätta dipeptiden Pro7-Phe8 med d-Tic-Oic (67-69). En prototyp av varje antagonistserie redovisas i tabell V för att visa att b-2-thienyl-elanin (Thi) inte behövs i positionerna 5 och 9, medan Hyp3 och d-Arg0 är viktiga för affiniteten, särskilt på RJV. Substitutionen av Phe8 med Leu, tillsammans med de andra modifieringarna, leder till d-ArgBK, som a) nästan saknar agonistisk aktivitet och b) är aktiv på RJV, mindre aktiv på GPI och ganska dålig på RA (B1), och därför är ganska selektiv för B2-platsen. Skillnaden mellan pA2-värdena (med två log-enheter) mellan RJV och GPI är ett avgörande resultat för den föreslagna (tabell V) indelningen av B2-receptorer i B2A (RJV) och B2B (GPI). D-ArgBK är en kompetitiv antagonist, snabbt reversibel både in vivo och in vitro och skiljer sig från Hoe 140, som är icke-kompetitiv (icke-jämvikt), troligen på grund av att den har en långvarig interaktion med både B2A- och B2B-platser (59, 67, 68, 70). Distinktionen mellan B2A och B2B stöds av de resultat som erhållits med de två sista föreningarna (tabell V), som skiljer sig åt genom resterna i den tredje positionen. Närvaron av Hyp gynnar antagonism (pA2 7,6) på B2A och partiell agonistisk aktivitet på B2B, medan Tyr3 ger en potent agonist på B2A och ganska bra antagonist (ren antagonist) på B2B. Denna nya klassificering har presenterats i en översiktsartikel (71). Kinins funktionella platser är därför B och B2 (två subtyper övervägs). Flera andra receptorer (B3, B4 och B5) har föreslagits (72-74) men deras existens har inte påvisats med solida experimentella data (se kritisk granskning i Ref. 59). Den kinininducerade histaminfrisättningen från peritoneala mastocyter från råttor är ett ospecifikt fenomen som har tillskrivits kininernas katjoniska karaktär (75, 76).