Djur

Alla möss var 3-11 månader gamla C57BL/6-hannar vid tidpunkten för testningen. Mössen köptes från Jackson laboratories, hölls i en temperatur- (22 °C) och ljuskontrollerad anläggning och fick fri tillgång till mat och vatten. Mössen avlivades genom isofluranöverdosering. Alla djurförsök och all användning av djur godkändes av den institutionella granskningskommittén vid East Carolina University. Djurvården överensstämde med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council (Washington: National Academy Press, 1996).

FDB-dissektion

Kritiskt för alla procedurer där FDB används är en noggrann dissektion som förhindrar skador på muskeln (muskeln är omgiven av ett område med tät bindväv) (se fig. 1). För att underlätta dissektionen fästes tårna på en korkbräda och foten fixerades på plats med fotsulan uppåt. Därefter klämdes huden i den proximala änden av foten (ovanför calcaneus) så att en mikrosax kunde göra snitt längs fotens sidokanter ner till tårna. Genom att fortfarande klämma fast huden ovanför hälsenan användes en mikrosax för att separera huden från den underliggande muskulaturen. Den kvarvarande hudfliken skalades tillbaka och avlägsnades för att frilägga FDB och tårnas senor. Den proximala senan skars sedan av, och samtidigt som senan hölls fast med en tång skars FDB bort från den underliggande fascian. Tåsenorna klipptes sedan för att frigöra FDB från foten.

Myofiberisolering

Efter dissektion av FDB placerades musklerna i färska odlingsmedier (DMEM med glutamin, 2 % sterilfiltrerad FBS, 0.1 % gentamycin) kompletterat med 4 mg/ml kollagenas A (Roche – 11088793001) i 90-120 minuter vid 37 °C i 5 % CO2 enligt tidigare beskrivning . FDB-muskeln placerades i 2 ml kulturmedium utan kollagenas och triturerades försiktigt mot skålens vägg för att frigöra fibrerna från buntet med hjälp av den skurna änden på en P1000-pipettspets. Isolerade myofibrer fästes på glasbottnar som var belagda med entactin-kollagen-laminin (ECL Cell attachment matrix, #08110 Millipore). Fibrerna återställdes till 37 °C i 5 % CO2 i flera timmar och avbildades därefter enligt beskrivningen nedan.

FDB-muskelfiberlängd

FDB-musklerna från manliga och kvinnliga C57BL/6-möss knöts vid den proximala senan och de tre mediala tåsenorna med silkesnärning och fästes på en metallklämma för att upprätthålla vilospänningen. Myofibrerna isolerades enligt beskrivningen ovan, men de fästes inte på glasbottenplattor. Myofibrerna avbildades med hjälp av ett ×4-objektiv och ett EVOS XL-kärnmikroskop med tillhörande programvara (Life Technologies, Bothell, WA). Längden på cirka 1 000 myofibrer mättes i ImageJ (version 1.6.0, NIH, Bethesda, MD). När myofibrerna isolerades var de inte längre spända och representerade därför inte den optimala längden. För att ta hänsyn till denna förändring av myofibrernas längd användes en omräkningsfaktor med hjälp av sarkomerlängden, som tidigare beskrivits av Dr Richard Lieber . Vid optimal längd är den antagna optimala sarkomerlängden för en myofibers muskulatur i musmuskulaturen 2,5 μm i tvärled . För att normalisera myofibrernas längd till sarkomerlängden mätte vi sarkomerlängden i en delmängd av 30 myofibrer. Avståndet mellan 10 sarkomerer i varje myofiber mättes och en genomsnittlig sarkomerlängd beräknades för alla 30 myofibrer. Den optimala sarkomerlängden (2,5 μm) dividerad med den genomsnittliga uppmätta sarkomerlängden gav en konverteringsfaktor på 1,14, som användes för att normalisera alla uppmätta myofiberlängder till den optimala sarkomerlängden.

Individuell fibertyp och fiberstorlek

Analysen av muskelfibertyp i FDB utfördes på prover från C57BL/6-möss, enligt tidigare beskrivning . Sektionerna provades med primära antikroppar mot myosin tung kedja typ I (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (Development Studies Hybridoma Bank, Univ of Iowa) och anti-dystrophin (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA), och avbildades sedan med hjälp av ett EVOS FL-automikroskop och tillhörande programvara (Life Technologies, Bothell, WA). Fibertyp och fiberns tvärsnittsarea (CSA) bedömdes med ImageJ, enligt tidigare beskrivning.

Isometrisk kraftproduktion

Isometrisk kraftproduktion och utmattning bedömdes i EDL- (n = 5), soleus- (n = 4) och FDB-musklerna (n = 6) hos C57BL/6-möss, enligt tidigare beskrivning med smärre ändringar. FDB exponerades och den proximala senan säkrades med hjälp av silkesnärning. En finspetsig pincett placerades under de tre mediala tåsenorna och drogs försiktigt ner mot tårna innan de tre senorna (fig. 1) fästes med silkesnärning. Vi band de tre mediala senorna eftersom det inte är möjligt att binda en av tårna på grund av den anatomiska placeringen, och att binda den fjärde senan resulterar enligt vår erfarenhet inte i en annan absolut kraft (data visas inte). Varje sena klipptes sedan av strax ovanför knuten och FDB lyftes försiktigt bort från foten. En mikrosax användes för att avlägsna eventuell kvarvarande bindväv och frigöra den från foten. Muskeln knöts sedan till en kraftomvandlare och suspenderades i syresatt Krebs Ringer Buffer (KRB- 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) vid rumstemperatur. Muskellängden justerades sedan tills FDB producerade en maximal ryckkraft, varefter den optimala vilospänningen (Lo) ställdes in och muskeln fick jämna ut sig i 10 minuter. Soleusmuskulaturen förbereddes genom att en dubbel kvadratisk knut knöts vid den distala soleussenan. Senan skars av ovanför knuten och de bakre musklerna drogs försiktigt bort från benet och avslöjade den proximala soleussenan, som knöts med en dubbel kvadratisk knut. EDL dissekerades och knöts på samma sätt som tidigare beskrivits. EDL- och soleusmusklerna jämnades ut i syresatt rumstempererad KRB vid vilospänning i 10 minuter. Efter jämvikten optimerades muskelspänningen genom att utföra maximala ryckstimuleringar och justera muskellängden tills toppkraft uppnåddes. Stimulanserna utfördes med 30 sekunders mellanrum för att undvika att trötta ut muskeln. Musklerna stimulerades sedan med 60 s mellanrum med 10, 20, 40, 60, 80, 100 och 120 Hz för att generera en kraftfrekvenskurva. Musklerna vilade i ytterligare 1 minut innan de genomförde ett 10-minutersprotokoll för stimulering för att bestämma utmattningsresistensen. I utmattningsprotokollet stimulerades musklerna med 30 Hz varannan 2:a sekund under en period av 600 s för totalt 300 sammandragningar. Den optimala muskellängden registrerades och musklerna blottlades för att avlägsna överskott av KRB innan de vägdes. En optimal spänning på 20 V fastställdes före experimenten för att säkerställa maximal stimulering av FDB, EDL och soleus (data visas inte). Absoluta muskelkraftdata konverterades till specifik kraft (N/cm2) med hjälp av tidigare beskrivna ekvationer för matematisk uppskattning av muskelns CSA och fysiologisk tvärsnittsarea (PCSA) . Den främsta skillnaden mellan CSA och PCSA är att förhållandet mellan muskelfiberlängd och muskellängd ingår i PCSA-ekvationen. Vi använde båda de korrigerade metoderna för att ge en bredare kompatibilitet med litteraturen.

Passiva kontraktila egenskaper

Passiva kontraktila egenskaper bedömdes i EDL- och FDB-musklerna från C57BL/6-hanmöss (n = 4), enligt tidigare beskrivning , med smärre ändringar. EDL- och FDB-musklerna dissekerades och knöts till en kraftomvandlare enligt beskrivningen ovan. Musklerna jämnades ut i 10 minuter i syresatt KRB vid rumstemperatur. Efter jämvikten optimerades muskelspänningen genom att utföra maximala stimuleringar av ryckningar och justera muskellängden tills maximal kraft uppnåddes. Stimulanserna utfördes med 30 sekunders mellanrum för att undvika att trötta ut muskeln. Muskelreferenslängden mättes som Lo innan den genomgick en passiv sträckning på 105, 110, 115, 120, 125 och 130 % av Lo. Musklerna torkades för att avlägsna överskott av KRB och vägdes sedan. Data korrigerades för CSA och PCSA.

Kardiotoxin (CTX)-skada

Varje gång gjordes jämförelser i C57BL/6-möss mellan en CTX-behandlad FDB (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) och en PBS-behandlad kontralateral FDB 4 dagar (n = 4) och 10 dagar efter behandlingen (n = 2). Sterila 8 mm långa 31G sprutor förbereddes med 10 μL 10 μM CTX eller 10 μL steril 1× PBS, enligt tidigare beskrivning . Efter isofluraninducerad bedövning rengjordes fotsulorna på fyra möss med alkoholtorkdukar. CTX injicerades i den proximala delen av foten med nålen placerad under huden och mot tårna. PBS injicerades i den kontralaterala foten. Mössen offrades vid lämplig tidpunkt och FDB:erna dissekerades för mätning av kraftproduktion enligt beskrivningen ovan. Data korrigerades till PCSA.

Hematoxylin- och eosinfärgning

FDB-muskler som utsatts för 10 dagars CTX-behandling snabbfrystes i lösning med optimal skärningstemperatur (OCT) för sektionering och H&E-färgning, enligt tidigare beskrivning .

Högupplöst mitokondriell respirometri i skelettmuskulaturen

Förberedelse av permeabiliserade gastrocnemius- och FDB-muskelfiberbuntar

Respirometri utfördes på isolerade permeabiliserade gastrocnemius- och FDB-muskelbuntar som skars ut från samma lem av C57BL/6-möss (n = 4). En del av den röda gastrocnemius dissekerades och användes för beredning av permeabiliserade fiberbuntar, enligt tidigare beskrivning . Röd gastrocnemiusmuskel användes som jämförelsevävnad eftersom den vanligen används för att bedöma murin skelettmuskulaturens mitokondriella respiration . Protokollet för framställning av permeabiliserade FDB-muskelfiberbuntar anpassades från tidigare beskrivna metoder för permeabilisering av röda gastrocnemiusmuskelbuntar och beskrivs nedan. FDB:erna dissekerades och lades omedelbart i iskall buffert X (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 imidazol, 20 taurin, 5,7 ATP, 14,3 fosfokreatin, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH2O). Med hjälp av ett dissektionsmikroskop avlägsnades bindväv, fett och blodkärl försiktigt för att undvika muskelförlust. FDB:er klipptes till buntar och delades upp i grupper om tre till fyra buntar som vägde 1,5-2,0 mg våtvikt. Grupperna av buntar permeabiliserades sedan i buffert X som innehöll 22,5 μg/ml saponin med kontinuerlig rotation vid 4 °C i 5 minuter. Muskelbuntarna överfördes omedelbart till iskall buffert Z (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) och tvättades med kontinuerlig rotation vid 4 °C i 15 minuter.

Mitokondriell respiration

Mätningar av O2-konsumtion med hög upplösning gjordes med hjälp av OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Österrike) vid 37 °C med en startsyrekoncentration på ~ 300-350 μM enligt tidigare beskrivning . Experimenten utfördes i buffert Z som innehöll 20 mM kreatinmonohydrat och 25 μM blebbistatin. Mitokondriell respiration bedömdes genom sekventiell tillsats av substrat i slutkoncentrationen pyruvat 4 mM, malat 0,5 mM, glutamat 5 mM, ADP 2.5 mM, succinat 5 mM, cytokrom c 5 μM, rotenon 10 μM, antimycin A 5 μM, askorbinsyra 2 mM och TMPD 0,5 mM (N,N,N′,N′-tetrametyl-p-fenylendiamin dihydrochlorid). Mitokondriemembranets integritet bekräftades genom att utesluta gastrocnemiusmuskelbuntar och FDB-muskelbuntar som gav en > 10 respektive > 20 % ökning av respirationen efter tillsats av exogent cytokrom c. Ett annat uteslutningskriterium användes för gastrocnemius- och FDB-muskelbuntar eftersom preliminära tester visade att en större procentuell ökning av respirationen var vanlig i FDB-fiberbuntar jämfört med gastrocnemius-fiberbuntar efter tillsats av cytokrom c. Efter avslutat protokoll sköljdes muskelbuntarna i destillerat H2O, frystorkades (Labconco, Kansas City, MO) och vägdes (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). Respirationstakten för intakta gastrocnemiusmuskelbuntar korrigeras vanligen till torrvikt, men på grund av skillnader i bindvävsinnehållet i de två muskelgrupperna korrigerades JO2-värdena också till totalt protein och citratsyntasaktivitet (CS). CS-aktiviteten mättes med hjälp av kit CS0720. Kemikalier och reagenser köptes från Sigma Aldrich.

Mikroskopi

In vitro

FDB-muskelfibrer isolerades från C57BL/6-möss och fästes på 35 mm glasbottenskålar som belagts med ECL, enligt tidigare diskussion. Isolerade myofibrer färgades med mitotracker deep red (M2246, Thermo Fisher) och NucBlue (R37605, Thermo Fisher) i DMEM i 30 minuter. Fibrerna tvättades tre gånger med 2 mL KRB. Fibrerna avbildades med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop med en enda foton med ett ×60 oljeimmersionsobjektiv (Olympus, Plan Apochromat, NA 1,35) och excitation uppnåddes med hjälp av 405- och 488-nm-linjerna i en multiline argonlaser.

In vivo

Sekundharmonisk generering beskriver den optiska effekt som uppstår när laserpulser passerar genom starkt polariserade, icke-centriskt symmetriska material, såsom myosin. När dessa material polariseras vid lämplig våglängd avger de ljus med halva våglängden för den inkommande våglängden, vilket ger högupplösta bilder utan behov av fluorescerande prober som är utsatta för fotoblekning och fototoxicitet. De nära infraröda våglängder som används gör det dessutom möjligt att tränga djupt in i vävnaden utan att det krävs invasiva ingrepp . C57BL/6-möss sövdes innan huden som täcker FDB avlägsnades och FDB-muskeln exponerades. När FDB väl var exponerad hydrerades den med steril KRB och musen lades på ett täckglas (#1,5, Leica), enligt tidigare beskrivning (fig. 1C). Myosin- och nikotinamidinnehållande molekyler exciterades vid 900 och 720 nm med hjälp av en pulserad Ti:Sapphire-laser med låst läge (Mai Tai Deep See HP-serien, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA), och emissionen registrerades med hjälp av icke-deskannad detektion med ett FV10 MRV/G-filter inställt vid 450 respektive 420 nm. Alla bilder togs med hjälp av ett ×60 oljeimmersionsobjektiv (Plan Apochromat, NA 1,35) och en Olympus FV1000 LSM med FV10-ASW 4.2 programvara.

CDNA-elektroporation och högupplöst respirometri av skelettmuskler som överuttrycker Pgc1α

Elektroporation av cDNA till FDB utfördes enligt tidigare beskrivning. Kortfattat rengjordes fötterna på sju sövda C57BL/6 han- och honmöss med en alkoholtork och fotkuddarna injicerades med 10 μl 2 mg/mL hyaluronidas suspenderat i sterilfiltrerad KRB med hjälp av en 8 mm lång 31 gauge steril nål. Ungefär 1 timme senare sövdes mössen för andra gången. Fötterna rengjordes återigen med en alkoholtork och den ena foten fick 30 μg grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt PGC1α-plasmid och den kontralaterala foten injicerades med YFP cDNA. Efter fullständig återhämtning från bedövningen sövdes mössen en tredje gång ~ 10 minuter senare. Platinelektroder fördes in under huden och placerades vinkelrätt mot FDB och parallellt med varandra vid hälen och fotballen under tårna. FDB stimulerades med 20 pulser av 20 ms varaktighet vid 1 Hz och 100 V . Mössen offrades 14 dagar senare och FDB:erna dissekerades och avbildades i ett fluorescerande mikroskop för att bekräfta plasmiduttrycket. Intakta FDB-muskelprover preparerades sedan och mättes för mitokondriell respiration enligt skissen ovan.

Statistik

Datafördelningar bedömdes och data som inte överensstämde med en normalfördelning logbas 10-transformerades. Kraftfrekvenskontraktil data analyserades via tvåvägs ANOVA med Tukey multipla jämförelser. Muskelmassa, fibertyp, tid till max och halva avspänning och utmattningsdata analyserades via envägs ANOVA med Tukey multipla jämförelser. I de fall då data inte kunde transformeras till en normalfördelning utfördes ett Kruskal-Wallis-test med Dunns multipla jämförelser. ANOVA:er genomfördes med hjälp av GraphPad Prism 7.03. Andningsdata och CS-aktivitet analyserades via parade tvåsidiga t-test med en alfa-nivå på 0,05 med hjälp av Microsoft Excel. Alla data presenteras som medelvärde ± SEM.