Charles V var tvungen att hitta ett annat porträtt, det som Isabella av Portugal skickade till Margret från Österrike innan hon dog. Hans syster skickade porträttet i november Karl var mycket besviken över att det inte såg ut som ett porträtt för hans hustru. Eftersom han var missnöjd med porträttet var han tvungen att be Titian att hitta en konst som liknade hans hustru.
Titian målade Isabella-porträttet 1545, Titian möblerade det och Karls hustru hade svart klänning och i sitt knä hade hon blommor bakom sig hade hon en magnifik krona. I EI Pardo palatset förstördes denna konst med hjälp av en brand denna historia finns i tryck och flera kopior. Porträttet hade förlorat näsan så Karl tog det till Augsburg så att konstnären kunde arbeta på det för att måla om näsan. I september 1548 använde konstnären den gamla modellen för att göra den nuvarande och den målades också i Augsburg. Karl och Isabella hade ett porträtt tillsammans och en kopia i Fundacion Casa de Alba Collection i Madrid.Detta var den bästa och första kombinationen av Isabella av Portugal och Karl V.
Titians konst förde med sig minnen av Isabella av Portugal och det porträtt som hade båda två påminde Karl om hans fru. Karl begärde konst och han ville inte ha exakta målningar utan ville visualisera dem han hade i tankarna. Karl ville att Tizian skulle måla porträttet av den förlorade näsan eftersom han kunde måla det så som näsan såg ut. De porträtt som gjordes under hennes livstid såg verkliga ut och visade hur Isabella av Portugal hade en akvilinjär näsa, vilket var ett unikt drag som uppmärksammades av många. Titian var tvungen att göra samma korrigering från en klassisk rak näsa till en böjd näsa som Isabella av Portugal hade. De små sakerna i porträtten som gav minnen av Isabella fick Karl att hålla konsten nära och allt detta finns med i dokument som Yuste och Bryssel där det senare dokumenterades 1556 och det förstnämnda 1558.
De porträtt som Tizian gjorde låg nära Giulio Romanos porträtt. Den av Eleonora Gonzaga en Urbino hertiginna är vad Titian tittade på och använde färdigheterna i målningarna för att göra Isabella porträtt. Bilderna av Isabella av Portugal var på något sätt utmanande, eftersom det inte var en verklighet utan bara en för att väcka minnen. Porträtt av Isabella av Portugal var ett bra jobb som Titian gjorde, men om man tittade närmare visade det sig att den använda duken tidigare var en konst av en kvinna. Den målade duken Isabella av Portugal gavs till Maria, syster till Filip den andre. Den var avsedd för ett kloster som hette Descalzas Reales. År 1636 togs den till Madrid i Alcazar och förblev där i samma år tills det brann år 1734.