Cellkulturer och RNAi

Drosophila melanogaster S2-cellinjen (från samlingen av IMG RAS) och Kc167-cellinjen (från Drosophila Genomics Resource Center) odlades vid 25 °C i Schneiders Drosophila Medium (Gibco) kompletterat med 10 % värme-inaktiverat fetalt bovint serum (FBS, Gibco), 50 enheter/ml penicillin och 50 µg/ml streptomycin. OSCs47 som vänligen tillhandahölls av M. Siomi odlades i Shields och Sang M3 insektsmedium (Sigma-Aldrich) kompletterat med 10 % värmeaktiverat FBS (Gibco), 10 % flugextrakt (http://biology.st-andrews.ac.uk/sites/flycell/flyextract.html), 10 µg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0,6 mg/ml glutathion (Sigma-Aldrich), 50 enheter/ml penicillin och 50 µg/ml streptomycin. dsRNA mot lacZ eller lamin Dm0 för RNAi-behandling av S2-celler framställdes enligt tidigare beskrivning11. dsRNA mot LBR framställdes på samma sätt med Drosophila-genom-DNA som mall för PCR-amplifiering och primers som tillhandahålls i den kompletterande tabellen 1. Behandling av celler med dsRNA utfördes under fyra dagar enligt ett tidigare beskrivet protokoll48.

Western-blot-analys

Proteiner extraherades med 8 M urea, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 1 % SDS, fraktionerades genom SDS-PAGE (12 % akrylamidgel) och överfördes till ett PVDF-membran (Immobilon-P, Millipore). Blots utvecklades med alkalisk fosfatas-konjugerade sekundära antikroppar (Sigma) och Immun-Star AP-detektionssystemet (Bio-Rad). Följande antikroppar användes för detektion: murin monoklonal anti-lamin Dm0 (1:2000; ADL6749), kaninpolyklonal anti-lamin C25 (1:10000), murin monoklonal anti-beta Actin (1:3000; ab8224, Abcam).

Kromatinvisualisering genom histon H4- eller DAPI-färgning

Lam-KD, LBR-KD eller kontroll S2-celler såddes på täckglas i 30 minuter. Efter sköljning med PBS fixerades cellerna i 100 % metanol i 5 minuter i rumstemperatur (för ytterligare undersökning av kromatinfördelningen baserad på immunfärgning av histon H4) eller i 4 % formaldehyd i PBS i 25 minuter i rumstemperatur (för ytterligare uppskattning av kromatinvolymen baserad på DAPI-färgning), sköljdes med PBS tre gånger, blockerades med PBTX (PBS med 0,1 % Tween-20 och 0,3 % Triton X-100) med 3 % normalt getserum (Invitrogen) i 1 timme i rumstemperatur. Den övriga immunfärgningsproceduren utfördes enligt tidigare beskrivning50. Som primära antikroppar använde vi murin monoklonal anti-histone H4 (1:200; ab31830, Abcam), polyklonalt anti-LBR26 från marsvin (1:1000), polyklonalt anti-lamin Dm051 från kanin (1:500). Som sekundära antikroppar använde vi Alexa Fluor 546-konjugerat get anti-kanin-IgG (Invitrogen) eller Alexa Fluor 488-konjugerat get anti-mus-IgG (Invitrogen) eller Alexa Fluor 633-konjugerat get anti-muss-IgG (Invitrogen).

ImageJ-kvantifiering av kromatinfördelning

Med hjälp av ImageJ mätte vi histon H4-, LBR- och lamin Dm0-profiler över kärndiametern i det ekvatoriala fokalplanet i kärnor från Lam-KD, LBR-KD eller kontroll S2-celler. Fluorescerande intensiteter extraherades, individuella profiler normaliserades först till den genomsnittliga intensiteten, sedan till kärnans diameter (avgränsad av toppar av LBR-fluorescens för Lam-KD, eller av toppar av lamin Dm0-fluorescens för LBR-KD) och anpassades ytterligare för att bestämma den genomsnittliga profilen. Kärnor från 2-3 oberoende experiment (60 kärnor per experiment) analyserades.

Bedömning av volymen av DAPI-färgat kromatin

Konfokala bilder som innehöll 20-30 DAPI-färgade formaldehydfixerade Lam-KD- eller kontroll-S2-celler bearbetades och analyserades med samma parametrar med hjälp av programvaran IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG). Endast kärnor med den lägsta kvarvarande lamin Dm0-färgningen användes för analys i Lam-KD-celler, medan kärnor med dålig lamin Dm0-färgning i kontrollceller omvänt inte togs med för analys. För subtraktion av bakgrunden trösklades bilderna till ~15 % av kanalens maximala intensitet så att de genererade kärnytorna inte skulle expandera bortom toppen av LBR-fluorescensintensiteten. Med dessa parametrar rekonstruerades kärnornas ytor, som var lämpliga för analys, automatiskt. Slutligen hämtades volymerna för ~100 rekonstruerade kärnor från statistikfliken för analys.

Two-colour FISH

~20-kb FISH-prober genererades med hjälp av ett PCR-kit med lång räckvidd (Encyclo Plus PCR (Evrogen)) genom PCR-amplifiering av 4 kakelgenomfragment som täcker antingen regionen 2 L:16964000-16982000 eller 2 L:17310000-17328000, med hjälp av de primerpar som anges i den kompletterande tabellen 1. 1 µg DNA-mall för hybridisering märktes genom slumpmässig primsyntes med DIG DNA-märkningskit (Roche) eller med ChromaTide Alexa Fluor 546-14-dUTP (Life Technologies). Proberna kombinerades ytterligare och hybridiserades med S2-celler enligt tidigare beskrivning23. För NL- eller FISH-sonddetektion använde vi som primära antikroppar marsvinspolyklonalt anti-LBR26 (1:1000) eller kaninpolyklonalt anti-lamin Dm051 (1:500) och fårpolyklonalt anti-DIG-FITC (1:500, Roche). Som sekundära antikroppar använde vi Alexa Fluor 633-konjugerat get-anticiner IgG (Invitrogen) eller Alexa Fluor 546-konjugerat get-antikanin-IgG (Invitrogen) och Alexa Fluor 488-konjugerat get-antifITC-IgG (Invitrogen).

Mätning av avstånden mellan FISH-sonderna och NE

Tredimensionella bildstaplar registrerades med ett konfokalt LSM 510 Meta laserskanningsmikroskop (Zeiss). Optiska sektioner med 0,4 μm intervall längs Z-axeln togs upp. Bilderna bearbetades och analyserades med hjälp av programvaran IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG) med blind experimentuppställning. Avstånd mellan båda proberna eller mellan proberna och NE räknades enligt tidigare beskrivning23. I korthet kunde vi inte fullständigt rekonstruera kärnornas ytor automatiskt utifrån deras LBR- eller lamin Dm0-immunfärgning. Därför avgränsades kärnkanten för en viss kärna manuellt i alla optiska sektioner av stapeln genom mitten av dess LBR- eller lamin Dm0-färgning för att ytterligare rekonstruera ytan av denna kärna automatiskt. För att bestämma avståndet mellan FISH-signaler och NE placerades instrumentets ”mätpunkt” på FISH-sondens ljusaste voxel och en annan ”mätpunkt” placerades på den rekonstruerade kärnytan i den punkt där den tidigaste skärningspunkten med en progressivt växande sfär från den första ”mätpunkten”. Avståndet mellan två ”mätpunkter” (dvs. det kortaste avståndet mellan FISH-sondens centrum och NE:s mitt) mättes för varje kärna. Avstånd mellan två FISH-sonder mättes på motsvarande sätt. Data erhölls i två oberoende experiment för 75-100 kärnor per experiment. Parallellt med detta beräknades kärnornas volymer, och kärnornas radier beräknades med utgångspunkt från att kärnorna var sfäriska. Slutligen normaliserades avstånden till kärnornas radier.

Analys av genuttryck

Totalt RNA isolerades från Lam-KD- eller kontroll-S2-celler med hjälp av Trizol-reagens (Invitrogen), och kontaminerande DNA avlägsnades genom DNase I-behandling. RNA-kvaliteten bedömdes med hjälp av kapillärelektrofores med en Bioanalyzer 2100 (Agilent). Poly(A)+-RNA extraherades från totalt RNA med hjälp av oligo(dT)-magnetpärlor (Thermo Fisher Scientific). NEBNext Ultra II RNA library preparation kit (New England Biolabs) användes för framställning av bibliotek enligt tillverkarens anvisningar. Bibliotek från två biologiska replikat av Lam-KD- eller kontroll-S2-celler kvantifierades med hjälp av en Qubit-fluorometer och kvantitativ PCR och sekvenserades på Illumina NextSeq, vilket resulterade i 8,4-9,4 × 106 80-nt single-end reads med 80-nt. Läsningarna kartlades till D. melanogaster-referensgenomet (version dm3) med hjälp av HISAT52 v2.1.0 med alternativet -max-intronlen 50 000. Läser med låg kartläggningskvalitet togs bort med hjälp av SAMtools53 med alternativet -q 30. Vi beräknade log2-transkriptionsnivåer i 20-kb genomiska bins med BEDtools54 v2.16.2 med alternativet -split, och tillämpade sedan funktionen hclust i R för att klustra replikaten med hjälp av 1-Spearmans korrelationskoefficient som avståndsmetriskt mått. Genuttrycket kvantifierades med StringTie52 för referensannotationen version r5.12. Vi filtrerade bort gener med nolluttryck i mer än två replikat. Bland de återstående 10 076 generna definierades de differentiellt uttryckta generna med hjälp av edgeR55-paketet med trimmat medelvärde av M-värden (TMM) normalisering vid FDR = 0,05 cutoff. Generna hänfördes till LAD om deras TSS låg inom LAD, medan generna hänfördes till inter-LAD om deras TSS låg minst 1 kb från LAD. Ett pseudoantal lades till alla uttrycksvärden för att eliminera nollor. Pseudoantalet beräknades som det minsta värdet i genuttryckstabellen efter normalisering. Sedan räknade vi ut medelvärdet av replikaten och beräknade log2(FC)-värden mellan Lam-KD- och kontrollprover.

RTP-qPCR-analys i realtid för de slumpmässigt utvalda generna från olika LAD:er utfördes på cDNA:er som syntetiserats med oligo(dT)-primers på poly(A)+ RNA som isolerats från tre biologiska replikat av Lam-KD- eller kontroll-S2-celler, med hjälp av EvaGreen-kemi (Jena Bioscience) och CFX96-hårdvaran (BioRad). Genernas uttrycksnivåer normaliserades utifrån act5C-genuttrycket. För semikvantitativ RT-PCR, som användes för analys av gener från 60D LAD, utfördes den omvända transkriptionen av RNA med hjälp av SuperScript II omvänt transkriptas (Invitrogen) i närvaro av slumpmässiga hexamerprimer. PCR-amplifiering av cDNA:er utfördes med tillsats av 33P-dATP. Proberna efter PCR separerades i 5 % PAAG, som sedan fixerades, torkades och exponerades för lagringsfosforskärmen (Amersham Biosciences). Signalerna skannades med en Phosphorimager Storm-820 (Molecular Dynamics). För varje primerpar optimerades antalet PCR-cykler för att passa amplifieringens exponentiella fas som kontrollerades av tvåfaldig cDNA-spädning. Genernas uttrycksnivåer normaliserades till uttrycket av den allestädes närvarande genen CG4589. Sekvenser av genspecifika primers presenteras i den kompletterande tabellen 1.

ChIP-seq-förfarande och dataanalys

ChIP-seq från två biologiska replikat av kontroll- och Lam-KD S2-celler med anti-H3-pan acetylerade antikroppar (Active Motif, #39139) utfördes som tidigare beskrivet56, med vissa ändringar. Efter sköljning med PBS fixerades ~2 × 107 celler med 1,8 % formaldehyd i PBS innehållande 0,5 mM DTT i 20 minuter i rumstemperatur. Korsbindningen stoppades genom att tillsätta glycin till 225 mM i 5 minuter och tvättades i PBS innehållande 0,5 mM DTT tre gånger i 5 minuter. Cellerna tvättades en gång i A2-buffert (140 mM NaCl, 15 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 0,1 % natriumdeoxycholat, 0,5 mM DTT, komplett EDTA-fri proteashämmarecocktail (Roche)). Cellerna lyserades i A2-buffert innehållande 1 % SDS i 10 minuter i rumstemperatur, varefter lysatet späddes 20 gånger med A2-buffert och inkuberades i 2 minuter vid 4 °C. Efter sonikation med VCX 400 Vibra-Cell Processor (Sonics; 30 pulser på 10 sekunder med 10 sekunders mellanrum vid 15 % maxeffekt) och 10 minuters höghastighetscentrifugering återfanns det fragmenterade kromatinet (med en genomsnittlig DNA-fragmentstorlek på ~0,5 kb) i supernatanten. För varje immunutfällning förinkuberades ~10 μg kromatin (~700 µl) i närvaro av 100 μl protein A-sefaros (PAS, 50 % w/v, GE Healthcare) i 1 timme vid 4 °C. PAS avlägsnades genom centrifugering, 5 % av kromatinet isolerades som ett ”Input”-material, varefter 2 µl anti-H3-pan acetylerade antikroppar (Active Motif, #39139) tillsattes till resten av kromatinet och proverna inkuberades över natten vid 4 °C i ett roterande hjul. Därefter tillsattes 100 μl PAS och inkuberingen fortsatte i 4 timmar vid 4 °C. Proverna centrifugerades vid högsta hastighet i 1 min och supernatanten kasserades. Proverna tvättades fyra gånger i A2-buffert innehållande 0,05 % SDS och två gånger i 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 0,5 mM DTT-buffert (varje tvätt i 5 minuter vid 4 °C). Kromatin eluerades från PAS i 100 μl 10 mM EDTA, 1 % SDS, 50 mM Tris (pH 8) vid 65 °C i 10 minuter, följt av centrifugering och återvinning av supernatanten. PAS-materialet extraherades på nytt i 150 μl TE, 0,67 % SDS. För att upphäva tvärbindningar inkuberades det kombinerade eluatet (250 μl) 6 timmar vid 65 °C och behandlades med proteinas K i 3 timmar vid 50 °C. Proverna extraherades med fenolklorform och fälldes med isopropanol i närvaro av 20 μg glykogen. DNA löstes upp i 100 μl vatten. ChIP-prover som innehöll ~25 ng utfällt DNA samt ”input”-prover förbereddes för nästa generations sekvensering med hjälp av ett NEBNext Ultra II DNA-biblioteksberedningskit för Illumina (New England Biolabs). Biblioteken sekvenserades på Illumina HiSeq 2000, vilket resulterade i 3,1-3,4 × 106 75-bp single-end reads på 75-bp. Läsningarna kartlades till D. melanogaster-referensgenomet (version dm3) med Bowtie 2 v2.2.1 (med alternativet -very-sensitive)57. Läsuppgifter med låg kartläggningskvalitet togs bort med hjälp av SAMtools53 med alternativet -q 30. Dubbla läsningar togs bort med hjälp av SAMtools rmdup. Vi beräknade log2 ChIP- och inmatningssignaler i genomiska bins på 1 kb med BEDtools54 v2.16.2 och tillämpade sedan funktionen hclust i R för att klustra replikaten med hjälp av 1-Spearmans korrelationskoefficient som avståndsmetriskt mått. Läsningar tilldelades LADs om de överlappade LADs, medan läsningar tilldelades inter-LADs om de var minst 1 kb från LADs. Vi beräknade antalet läsningar inom varje LAD och inter-LAD, normaliserade värdena för summan av lästäckningen per replikat, uteslöt nolltäckta LAD:er och inter-LAD:er från vidare analys, tog medelvärdet av replikerna och beräknade log2(FC)-värdena mellan Lam-KD- och kontrollchip-prover.

Hi-C-förfarande och dataanalys

Hi-C-bibliotek från två oberoende biologiska replikat av kontroll- och Lam-KD S2-celler framställdes i huvudsak enligt tidigare beskrivning36 med hjälp av restriktionsenzym HindIII-HF (NEB). Biblioteken sekvenserades på Illumina HiSeq 2000-plattformen, vilket resulterade i 3-4 × 107 parvisa läsningar. Läsningarna kartlades till D. melanogaster-referensgenomet (version dm3) med Bowtie 2 v2.2.1 (med alternativet -very-sensitive)57. Hi-C-data bearbetades med hjälp av ICE-pipeline v0.9 (20 iterationer av iterativ korrigering) enligt beskrivningen58. Hi-C-interaktionskartor med 20 kb-upplösning erhölls. TAD:er förutsades med hjälp av programvaran Armatus59 v1.0, där den genomsnittliga storleken och antalet TAD:er bestäms av skalparametern γ. TAD-annoteringen utfördes i två steg enligt beskrivningen36. Först valde vi manuellt parametern γ för att uppnå en god uppdelning av TADs (γ = 1,20 för Lam-KD-celler och γ = 1,12 för kontrollceller). Därefter delades TAD:er som var större än 600 kb upp i mindre TAD:er med skalparametern γ multiplicerad med 2. Därefter antecknades de minsta TAD:erna (lika med eller mindre än 60 kb) som inter-TAD:er på grund av deras dåligt upplösta inre struktur. Som ett resultat avslöjades 576 (i kontrollen) och 588 (i Lam-KD) TADs. För att undersöka om TAD-positionerna ändras vid Lam-KD analyserade vi graden av överlappning av varje TAD i de sammanslagna replikerna av kontroll- och Lam-KD-celler med den i kontrollreplikaten eller i Lam-KD-replikerna och fann ingen statistiskt signifikant skillnad (P > 0,05 i ett tvåsidigt Wilcoxon-test). ACF inom varje TAD beräknades som ett medelvärde av iterativt korrigerade läsnummer mellan alla genomiska bins som tillhör TAD, exklusive gränsbins från båda TAD-sidorna. ACF inom varje inter-TAD beräknades som ett medelvärde av iterativt korrigerade avläsningssiffror mellan alla genomiska bins som tillhör inter-TAD och gränsbins från angränsande TAD:er. För varje TAD beräknade vi förhållandet mellan ACF-värdet i varje Lam-KD- replikat och ACF-värdet i varje kontrollreplikat (totalt fyra förhållanden). TAD:er med minst tre förhållanden med samma tecken användes för nedströmsanalysen. Vi noterar att när vi valde ut TAD:er enligt ett strängare kriterium (dvs. alla fyra förhållandena ändrades i samma riktning) påverkade det inte analysresultaten (kompletterande figur 6). Kromatinkompartment annoterades med hjälp av huvudkomponentanalysen enligt beskrivningen17. Saddle plots genererades enligt beskrivningen58. I korthet använde vi de observerade/förväntade Hi-C-kartorna, som vi beräknade från 20-kb iterativt korrigerade interaktionskartor för cis-interaktioner genom att dela varje diagonal i en matris med dess kromosomövergripande medelvärde. I varje observerad/förväntad karta ordnade vi om raderna och kolumnerna i den ordning de ökande PC1-värdena (som vi beräknade för kontrollmatriserna). Slutligen aggregerade vi raderna och kolumnerna i den resulterande matrisen i 20 lika stora aggregerade bins, och fick på så sätt en sadeldiagram av kompartmentalisering.

Analys av publicerade data

Vi använde oss av annotering av kromatintyp för S2-celler40. Proportioner av kromatintyper i 20-kb-bins beräknades. Annotering av LADs hämtades från ref. 28. Vi beräknade andelen LAD-längd i varje 20-kb TAD bin.

Polymermodellering

Vi använde Dissipative Particle Dynamics (DPD) för att utföra datorsimuleringar, enligt tidigare beskrivning36 med vissa ändringar. I korthet representeras makromolekyler i termer av pärl- och fjädermodellen, där partiklarna interagerar med en konservativ kraft (repulsion), en dissipativ kraft (friktion) och en slumpmässig kraft (värmegenerator). En detaljerad beskrivning av genomförandet av denna teknik har lämnats tidigare60. Den simulerade cellvolymen var 50 × 50 × 50 × 50 DPD-enheter, densiteten är lika med 3, så det totala antalet partiklar i systemet är 375 000. Vi antar att en partikel motsvarar en nukleosom. Dessutom inför vi särskilda randvillkor, som är periodiska för lösningsmedlet och ogenomträngliga för andra partiklar. Ytan består av orörliga, hexagonalt placerade partiklar. I våra simuleringar efterliknar partiklarna antingen ”aktiva” eller ”inaktiva” nukleosomtyper, medan ytan efterliknar NL. ”Inaktiva” partiklar kan skapa reversibla ”mättande” bindningar61,62 med varandra och med partiklarna på ytan. Varje ”inaktiv” partikel kan ha endast en ytterligare bindning per moment, vilket simulerar en interaktion mellan en positivt laddad histonstjärt i en icke-acetylerad nukleosom och den ”sura delen” i en annan nukleosom42,43,63. Vår sampolymerkedja representeras av 64 block som var och en består av 500 ”inaktiva” och 50 ”aktiva” partiklar. Sannolikheten för att skapa en förening mellan två ”inaktiva” partiklar sattes till 0,001, mellan den ”inaktiva” partikeln och ytan – 0,007, medan sannolikheten för att bryta en sådan förening sattes till 0,01. Under simuleringarna kontrollerades alla partiklar var 200:e DPD-steg, när den lokala jämvikten uppnåtts. Vi utförde 10 oberoende körningar på MSU:s superdator ”Lomonosov-2” med hjälp av vår egen implementering av den parallelliserade DPD-koden för domändekomposition som finns tillgänglig på GitHub .

Statistisk analys

Vi tillämpade Wilcoxon-testet för att kontrollera om fördelningen av log2(FC)-värdena var symmetrisk kring noll, samt för att testa om två fördelningar av log2(FC)-värdena skiljde sig åt genom en platsförskjutning på noll.

Rapporteringssammandrag

För ytterligare information om den experimentella utformningen finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till denna artikel.