Abstract

Syftet med den här studien var att utvärdera flukonazols aktivitet mot 32 kliniska stammar av flukonazolresistenta Candida albicans, och C. albicans ATCC 10231-referensstam, efter deras exponering för subletala koncentrationer av tea tree oil (TTO) eller dess huvudsakliga bioaktiva komponent terpinen-4-ol. För alla testade flukonazolresistenta C. albicans-stammar var TTO:s och terpinen-4-ols minimala hämmande koncentrationer (MIC) låga, från 0,06 % till 0,5 %. 24-timmarsexponering av flukonazolresistenta C. albicans-stammar för flukonazol med subletala doser av TTO ökade flukonazolaktiviteten mot dessa stammar. Totalt sett klassificerades 62,5 % av isolaten som mottagliga, 25,0 % uppvisade intermediär känslighet och 12,5 % var resistenta. För alla testade kliniska stammar minskade flukonazol-MIC från i genomsnitt 244,0 μg/mL till i genomsnitt 38,46 μg/mL, och flukonazols minimala fungicida koncentrationer (MFC) minskade från i genomsnitt 254,67 μg/mL till i genomsnitt 66,62 μg/mL. Terpinen-4-ol visade sig vara mer aktiv än TTO och ökade kraftigt flukonazolaktiviteten mot flukonazolresistenta C. albicans-stammar. Resultaten av denna studie visar att en kombination av naturliga ämnen som TTO och konventionella läkemedel som flukonazol kan bidra till att behandla svåra jästinfektioner.

1. Introduktion

Äteriska oljor är antiseptiska ämnen som produceras av växter. Tea tree oil (TTO) är den eteriska olja som erhålls genom ångdestillation från den australiensiska inhemska växten Melaleuca alternifolia och används medicinskt som ett lokalt antiseptiskt medel. Den har ett brett spektrum av antimikrobiell aktivitet mot ett stort antal bakterier, virus och svampar, inklusive jäst och dermatofyter. TTO är en blandning av mer än 100 olika föreningar, främst terpener (främst monoterpener och sesquiterpener). De fysiska egenskaperna och den kemiska sammansättningen av TTO varierar och det är därför viktigt att fastställa internationella standarder. Den australiensiska standarden för tea tree oil (AS 2782-1985) innehåller direktiv om halterna av två komponenter: den lägsta halten terpinen-4-ol bör vara minst 30 % och den högsta halten 1,8-cineol bör vara mindre än 15 % av oljans volym . Den internationella standarden för tea tree oil (ISO 4730:2004) innehåller maximi- och minimivärden i procent för de 15 viktigaste komponenterna i TTO. TTO som erhålls genom ångdestillation av blad och slutgrenar av Melaleuca alternifolia Cheel, Melaleuca linariifolia Smith, Melaleuca dissitiflora F. Mueller och andra arter av Melaleuca bör överensstämma med denna standard .

TTO har använts i århundraden inom den australiska folkmedicinen, främst för sårbehandling . På 1920-talet beskrev Penfold för första gången TTO:s egenskaper och kemiska sammansättning, och han bekräftade senare de antiseptiska egenskaperna hos TTO och dess komponenter . På 1930-talet publicerades flera publikationer som visade på TTO:s kraftfulla antimikrobiella aktivitet vid användning i inhalationsterapi, aseptisk kirurgi, tandkirurgi, sårdesinfektion och sköljning av munhålan .

För närvarande används TTO som ett lokalt medel för behandling av olika sjukdomar, främst dermatoser (t.ex. återkommande herpes labialis, akne, pustler, mjäll och utslag). TTO används också för att behandla Staphylococcus aureus-infektioner i munhålan och svalget, vaginit och sjukdomar i luftvägarna. Många studier har bekräftat TTO:s breda antimikrobiella aktivitet mot bakterier, svampar och virus samt mikroorganismer som är resistenta mot konventionella läkemedel . Detta är viktigt på grund av ökningen av svårbehandlade infektioner, eftersom TTO kan användas som ett alternativ till eller i kombination med konventionella läkemedel (inklusive antibiotika och kemoterapeutiska medel).

Behandling av infektioner kan baseras på monoterapi (användning av ett antimikrobiellt läkemedel) eller kombinationsbehandling (två eller flera läkemedel). Det primära syftet med kombinationsbehandling är att förstärka läkemedlens verkan samtidigt som doserna minskas, genom synergism. När monoterapi eller kombinerad terapi baserad på konventionella läkemedel inte är framgångsrik kan en kombinerad behandling med ett naturligt medel vara mer effektiv. Flera nyligen genomförda studier har rapporterat om ökad antimikrobiell aktivitet hos naturliga substanser i kombination med konventionella läkemedel jämfört med behandling med enbart konventionella läkemedel .

Syftet med denna studie var att utvärdera flukonazols aktivitet mot kliniska stammar av flukonazolresistent Candida albicans och referensstam C. albicans ATCC 10231, efter deras exponering för subletala koncentrationer av TTO eller dess huvudsakliga bioaktiva komponent terpinen-4-ol.

2. Material och metoder

2.1. Candida albicans-stammar

Denna studie omfattade 32 kliniska Candida albicans-stammar som isolerades från följande material: svabbar från svalget och munhålan (), vagina (), sputum () eller avföring (). Dessa stammar isolerades genom odling på Sabouraud-agar (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Frankrike), och artbestämning utfördes med hjälp av det biokemiska testet ID 32C (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Frankrike). Vi använde också referensstammen C. albicans ATCC 10231, som köptes från Oxoid Ltd. (Basingstoke, Storbritannien). Vi har tidigare fastställt C. albicans-stammarnas känslighet för flukonazol med hjälp av Kirby-Bauer-diskdiffusionskänslighetstestet med hjälp av 6 mm filterpappersskivor impregnerade med 10 μg flukonazol som erhållits från DHN (Krakow, Polen) och YNB-agar (Yeast Nitrogen Base-Difco 0,5 %, glukos 3 %, agar 1,8 %, pH = 7) som också erhållits från DHN (Krakow, Polen). C. albicans-stammarna klassificerades som mottagliga (diameter av tillväxthämmande zon ≥18 mm), intermediärt mottagliga (diameter av tillväxthämmande zon från 14 mm till 17 mm) eller resistenta (diameter av tillväxthämmande zon <14 mm) för flukonazol (uppgifterna beskrivs i kapitel 3). Flukonazolvärdena MIC (minimal inhibitorisk koncentration) och MFC (minimal fungicid koncentration) bestämdes med hjälp av buljongutspädningsmetoden i enlighet med Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI-dokument M27-A3-2008) . Med hjälp av denna standard klassificerades C. albicans-stammarna som mottagliga (MIC ≤ 8 μg/mL), intermediärt mottagliga (MIC från 9 μg/mL till 63 μg/mL) eller resistenta (MIC ≥ 64 μg/mL) mot flukonazol (uppgifterna presenterades i kapitel 3).

2.2. Tea Tree Oil (TTO)

I den här studien använde vi australiensisk tea tree oil (Melaleuca alternifolia) från Thursday Plantation (Integria Healthcare, Eight Mile Plains, QLD, Australien) serie 270930 som överensstämmer med ISO-standarden 4730:2004 (tabell 1). TTO destillerades från särskilt utvalda blad av Melaleuca alternifolia, en växt som är inhemsk i kustregionerna i norra New South Wales och sydöstra Queensland i Australien. Analysen av TTO:s sammansättning utfördes med gaskromatografi enligt den internationella standarden ISO 4730 . Den utfördes under följande förhållanden: kolonn av smält kiseldioxid (50 m × 0,20 mm i.d.), filmtjocklek 0,25 μm) och detektor av flamjoniseringstyp användes, bärgasen var väte (flödeshastighet 1 ml/min), ugnens temperaturprogram var från 70 °C till 220 °C med en hastighet av 2 °C/min, injektortemperaturen var 230 °C, detektortemperaturen var 250 °C, volymen injicerad TTO var 0,2 μl och delningsförhållandet var 1:100.

I vår studie använde vi även terpinen-4-ol, som erhölls från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.3. Flukonazol

I denna studie använde vi det svampdödande läkemedlet flukonazol (Polfarmex, Kutno, Polen). Flukonazolmolekylens struktur visas i figur 1.

Figur 1

Flukonazols kemiska struktur .

2.4. Beredning av den initiala Candida albicans-suspensionen

C. albicans-celler som odlats i 24 timmar på Sabouraud-agar suspenderades i en saltlösning (0,85 % NaCl) och justerades till en 0,5 McFarland-densitetsstandard (1,5 × 108 CFU/mL). Denna suspension späddes senare till en densitet på 6 × 104 CFU/mL. Suspensionen användes sedan för att uppskatta MIC- och MFC-värdena för TTO, terpinen-4-ol och flukonazol.

2.5. Bestämning av MIC- och MFC-värden för TTO och terpinen-4-ol

TTO-aktiviteten mot de testade C. albicans-stammarna bestämdes genom makrodilution i buljong med hjälp av allmänna utspädningsstandarder enligt PN-EN ISO 20776-1:2007 . TTO späddes seriellt i flytande Sabouraud-medium med 10 % Tween 80 till slutliga TTO-koncentrationer på 1 % till 0,0075 %. Tvättmedlet Tween 80 hjälper till att lösa upp TTO. Samma volym av C. albicans-suspensionen tillsattes till varje rör för att få en slutlig densitet på 3 × 103 CFU/mL. Efter 24 timmars inkubation vid 35 °C bedömdes celltillväxten visuellt i rören med TTO och det positiva kontrollröret (utan TTO). MIC definierades som den lägsta koncentrationen av TTO som inte ledde till någon synlig tillväxt av de testade cellstammarna. MFC-värdet definierades som den lägsta koncentrationen av TTO som inte visade någon tillväxt av C. albicans-kolonier. Experimentet utfördes tre gånger. Terpinen-4-ol MIC- och MFC-värdena bestämdes på samma sätt som beskrivits ovan. MIC-värdena för TTO och terpinen-4-ol användes för att beräkna de subletala doser av TTO och terpinen-4-ol som användes i följande experiment.

2.6. Kort förbehandling av Candida albicans med 1/4 MIC TTO

För varje prov förbereddes ett rör som innehöll saltlösning med 10 % Tween 80 och TTO till en slutkoncentration på 1/4 MIC TTO. Ett kontrollrör utan TTO förbereddes också. Därefter tillsattes C. albicans-suspensionen till rören för att få en slutlig densitet på 3 × 103 CFU/mL. Suspensionerna inkuberades sedan vid 35 °C i 30 minuter. Proverna sköljdes sedan två gånger och centrifugerades mellan sköljningarna (3000 ×g, 15 minuter), och cellerna resuspenderades till en densitet på 6 × 104 CFU/mL. Suspensionen användes sedan för att bestämma flukonazol-MIC och den minimala fungicida koncentrationen (MFC) av flukonazol. Undersökningen utfördes i tre exemplar.

2.7. Bestämning av flukonazol MIC- och MFC-värdena efter kortvarig förbehandling av Candida albicans med 1/4 MIC TTO

Flukonazolaktiviteten mot de testade C. albicans-stammarna bestämdes genom makrodilution i buljong med hjälp av de allmänna utspädningsstandarderna som beskrivs i PN-EN ISO 20776-1:2007 . Seriella, parallella spädningar av flukonazol från 256,0 μg/ml till 0,125 μg/ml framställdes i flytande Sabouraud-medium, och ett kontrollrör utan läkemedlet ingick. För vart och ett av rören tillsattes samma volym C. albicans cellsuspension som förbehandlats med 1/4 MIC TTO, och inokulumet justerades till en slutlig densitet på 3 × 103 CFU/mL. Efter 24 timmars inkubation vid 35 °C bedömdes celltillväxten i varje rör visuellt. MIC-värdet definierades som den lägsta koncentration av flukonazol som inte resulterade i någon synlig tillväxt av de testade stammarna. Cellerna från det rör som identifierades som MIC, liksom flera av de omgivande utspädningarna, pläterades ut på Sabouraud-agar. Efter 24 timmars inkubation vid 35 °C räknades kolonierna av C. albicans. MFC-värdet definierades som den lägsta koncentration av flukonazol som inte visade någon tillväxt av C. albicans-kolonier. Försöket utfördes i tre exemplar. C. albicans-stammarna klassificerades som mottagliga, intermediärt mottagliga eller resistenta mot flukonazol enligt CLSI-dokument M27-A3-2008 , enligt beskrivningen i avsnitt 2.1.

2.8. Långvarig förbehandling av Candida albicans med flukonazol och subletala doser av TTO eller terpinen-4-ol

Seriella, parallella spädningar av flukonazol från 256,0 μg/mL till 0,125 μg/mL framställdes i flytande Sabouraud-kulturmedium. Två positiva kontroller inkluderades. Alla rör innehöll 10 % Tween 80, och TTO tillsattes till varje utspädning och ett av kontrollrören för att uppnå en slutkoncentration på 1/4 MIC TTO. Det andra kontrollröret innehöll endast det flytande mediet. Därefter tillsattes en lika stor volym C. albicans-suspension i varje rör till en slutlig densitet på 3 × 103 CFU/mL. Alla rören inkuberades vid 35 °C i 24 timmar. Efter inkuberingen utvärderades celltillväxten i varje rör visuellt, och flukonazol-MIC- och MFC-värdena fastställdes enligt tidigare beskrivning. Cellerna från det rör som identifierats som MIC, liksom flera av de omgivande utspädningarna, utplantades på Sabouraud-agar. Efter 24 timmars inkubation vid 35 °C räknades kolonierna av C. albicans och flukonazol MFC-värdet fastställdes. Försöket utfördes i tre exemplar. Den förlängda förbehandlingen av C. albicans med flukonazol och terpinen-4-ol utfördes på samma sätt som beskrivits ovan.

2.9. Statistiska metoder

Resultaten presenteras som aritmetiskt medelvärde och median. De statistiska skillnaderna mellan medelvärdena fastställdes med hjälp av Students test och Mann-Whitney-testet, beroende på hur väl resultaten överensstämde med en normalfördelning. Värden på ansågs vara statistiskt signifikanta. Programmet STATISTICA version 10 (StatSoft, Cracow, Polen) användes för att utföra de statistiska analyserna.

3. Resultat

De testade Candida albicans-stammarna var resistenta mot flukonazol och mottagliga för låga koncentrationer av TTO. De kliniska C. albicans-stammarna och C. albicans ATCC 10231-referensstammen, som testades med Kirby-Bauer-diskdiffusionskänslighetstestet, uppvisade inte någon zon för hämning av tillväxt. Alla undersökta C. albicans-stammar klassificerades som resistenta mot flukonazol. MIC-värdena för flukonazol för de 32 kliniska C. albicans-stammarna varierade från 64,0 μg/mL till 256,0 μg/mL (genomsnitt = 244,0 ± 47,22 μg/mL). De vanligaste värdena var 256,0 μg/mL (30 stammar) och 64,0 μg/mL (2 stammar). För C. albicans ATCC 10231-referensstammen var flukonazol-MIC 256,0 μg/mL.

TTO-MIC för de 32 kliniska C. albicans-stammarna varierade från 0,06 % till 0,5 % (genomsnitt = 0,19 ± 0,09 %). De vanligaste värdena var 0,125 % (15 stammar) och 0,25 % (15 stammar). TTO MIC för de två återstående stammarna var 0,06 % och 0,5 %. För C. albicans ATCC 10231-referensstammen var TTO MIC 0,125 %. Dessa resultat tyder på att de testade C. albicans-stammarna inte uppvisade någon korsresistens mot TTO och flukonazol. TTO MIC-värdena användes för att beräkna de subletala doser (1/4 MIC TTO) som användes i resten av studien.

Den korta förbehandlingen av 32 kliniska C. albicans-stammar och av C. albicans ATCC 10231-referensstammen med 1/4 MIC TTO förändrade inte flukonazol MIC- och MFC-värdena. Exponering av C. albicans-stammar för 1/4 MIC TTO och flukonazol i 24 timmar (långvarig förbehandling) ökade signifikant känsligheten hos jäststammarna för flukonazol. Av 32 flukonazolresistenta kliniska C. albicans-stammar uppvisade 28 stammar (87,5 %) då hög eller intermediär känslighet för flukonazol (tabell 2).

Candida albicans stammar ( = 32) Antal (%) av Candida albicans stammar med angiven känslighet för flukonazol Resistenta Intermediär känslighet Mottagliga Stammar som inte exponerats för TTO (kontroll) 32 100% 0 0 0 Stammar som exponerats för MIC TTO i 30 minuter 32 100% 0 0 Stammar som utsätts för MIC TTO och flukonazol i 24 timmar 4 12.5% 8 25,0% 20 62,5%

Tabell 2

Tillgänglighet för flukonazolresistenta kliniska Candida albicans-stammar mot flukonazol efter exponering för MIC TTO.

Exponering av flukonazolresistenta C. albicans-stammar i 24 timmar för 1/4 MIC TTO och flukonazol ökade flukonazolaktiviteten mot dessa stammar. Totalt sett klassificerades 62,5 % av isolaten som mottagliga, 25,0 % uppvisade intermediär känslighet och 12,5 % var resistenta. För alla testade kliniska stammar minskade den genomsnittliga flukonazol-MIC från 244,0 μg/mL till 38,46 μg/mL efter denna förlängda förbehandling, och den genomsnittliga flukonazol-MFC minskade från 254,67 μg/mL till 66,62 μg/mL (tabell 3). MIC- och MFC-värdena för de mottagliga stammarna () och stammarna med intermediär känslighet () var statistiskt låga jämfört med de analoga värden som erhölls för kontrollprovet och för de prover som endast kortvarigt förbehandlades med TTO. För gruppen mottagliga isolat minskade flukonazol-MIC till i genomsnitt 0,52 μg/mL och flukonazol-MFC till i genomsnitt 4,25 μg/mL. Långvarig förbehandling av Candida albicans ATCC 10231 standardstam med 1/4 MIC TTO och flukonazol ökade inte denna stams känslighet för flukonazol, i likhet med de fyra studerade flukonazolresistenta kliniska C. albicans-stammarna.

(a) Flukonazol MIC-värden (μg/mL)

C. albicans ( = 32)a C. albicans ( = 20)b C. albicans ( = 8)c Kontroll Kort förbehandling med TTO Prolongerad förbehandling med TTO och flukonazol Kontroll Kort förbehandling med TTO Prolongerad förbehandling med TTO och flukonazol Kontroll Kort förbehandling med TTO Prolongerad förbehandling med TTO och flukonazol MIKS-intervallet 64.0-256.0 64.0-256.0 0.125-256.0 256.0-256.0 256.0-256.0 0.125-2.67 64.0-256,0 64,0-256,0 12,0-42,67 Genomsnittlig MIC 244.0 ± 47.22 244.0 ± 47.22 38.46 ± 84.35 256.0 ± 0.0 256.0 ± 0.0 0.52 ± 0.56 208.0 ± 88.88 208.0 ± 88.88 24.54 ± 11.54 < 0.0001e < 0.0001f < 0.0001e < 0.0001f < 0.0002e < 0.0002f

(b) Flukonazol MFC-värden (μg/mL)

C. albicans ( = 32)a C. albicans ( = 20)b C. albicans ( = 8)c Kontroll Kort förbehandling med TTO Prolongerad förbehandling med TTO och flukonazol Kontroll Kort förbehandling med TTO Prolongerad förbehandling med TTO och flukonazol Kontroll Kort förbehandling med TTO Långvarig förbehandling med TTO och flukonazol Sortiment av MFC:er 213.33-256.0 256.0-256.0 0.17-256.0 256.0-256.0 256.0-256,0 0,17-23,33 213,33-256,0 256,0-256,0 14,67-213,33 Genomsnittlig MFC 254.48 ± 7.54 256.0 ± 0.0 66.62 ± 96.16 256.0 ± 0.0 256.0 ± 0.0 4.25 ± 6.19 250.67 ± 15.08 256.0 ± 0.0 127.83 ± 70.42 < 0.0001e < 0.0001f < 0.0001e < 0.0001f < 0,0003e < 0,0002f

Samtliga 32 testade flukonazolresistenta kliniska Candida albicans-stammar. bFlukonazolresistenta kliniska Candida albicans-stammar ( = 20) som uppvisade känslighet för flukonazol efter långvarig förbehandling med TTO. cFlukonazolresistenta kliniska Candida albicans-stammar ( = 8) som uppvisade intermediär känslighet för flukonazol efter långvarig förbehandling med TTO. : nivå av statistisk signifikans för de genomsnittliga MIC/MFC-värdena. : statistisk signifikans jämfört med kontrollen. : statistisk signifikans jämfört med gruppen som förbehandlades kortvarigt.

Tabell 3

Flukonazol MIC- (a) och MFC- (b) värden (μg/mL) för flukonazolresistenta kliniska stammar av Candida albicans efter exponering för MIC TTO.

Terpinen-4-ol, den viktigaste bioaktiva komponenten i TTO, ökade kraftigt flukonazolaktiviteten mot flukonazolresistenta C. albicans-stammar. Terpinen-4-ols MIC för kliniska C. albicans-stammar varierade från 0,06 % till 0,25 % (genomsnitt = 0,11 ± 0,09 %). För C. albicans ATCC 10231 standardstam var terpinen-4-ols MIC 0,06 %. De testade C. albicans-stammarna uppvisade ingen korsresistens mot terpinen-4-ol och flukonazol. Exponering av flukonazolresistenta kliniska stammar och standardstammar av C. albicans i 24 timmar för flukonazol och subletala doser (1/4 MIC) av terpinen-4-ol ökade kraftigt flukonazolaktiviteten mot dessa stammar, och alla C. albicans-isolat klassificerades som mottagliga (flukonazol-MIC minskade till 0,125 μg/mL). Vi sammanfattade resultaten av denna studie och de viktigaste uppgifterna presenteras i tabellform (tabell 4).

Reagens C. albicans ATCC 10231 C. albicans kliniska stammar ( = 32) MIC MFC MIC MFC Bredd Genomsnitt Genomsnitt Genomsnitt Flukonazol μg/mL 256.0 256.0 64.0-256.0 244.0 ± 47.22 213.33-256.0 254.48 ± 7.44 TTO % v/v 0.125 0.25 0,06-0,5 0,19 ± 0,09 0,125-0,5 0,37 ± 0,13 Flukonazol μg/mL med subletala doser av TTO 256.0 256.0 0.125-256.0 38.46 ± 84.35 0.17-256.0 66.62 ± 96,16 Terpinen-4-ol % v/v 0,06 0,125 0,06-0.25 0,11 ± 0,09 0,125-0,5 0,22 ± 0,19 Flukonazol μg/mL med subletala doser av terpinen-4-ol 0,125 0,125 0,125 0,125-0,125 0.125 ± 0.0 0.125-1.0 0.38 ± 0.42

Tabell 4

MIC- och MFC-värden för flukonazol, TTO, terpinen-4-ol och flukonazol med TTO eller terpinen-4-ol för flukonazolresistenta Candida albicans-stammar.

4. Diskussion

TTO är den mest använda eteriska oljan för sina antibakteriella och svampdödande egenskaper . I den här studien utvärderade vi förändringen av flukonazolaktiviteten in vitro mot flukonazolresistenta kliniska Candida albicans-stammar som utsattes för subletala koncentrationer av TTO eller terpinen-4-ol, den huvudsakliga bioaktiva komponenten i TTO. De tidigare in vitro-studierna av Candida spp:s känslighet för TTO har visat att TTO är mycket aktiv mot dessa mikrober, liksom mot azolresistenta stammar, för vilka TTO:s MIC varierade mellan 0,25 % och 0,5 % . För de C. albicans-stammar som var resistenta mot både flukonazol och itrakonazol varierade TTO:s MIC från 0,25 till 1,0 %, TTO MIC50 var 0,5 % och TTO MIC90 var 1 % . En annan studie visade att tre flukonazolresistenta kliniska C. albicans-stammar hade mycket låga TTO MICs (0,15 % för två stammar och 0,07 % för den tredje stammen) .

Experimenten som utfördes i den här studien bekräftar resultaten från tidigare publicerade studier i det att alla testade flukonazolresistenta C. albicans-stammar var känsliga för TTO . De fastställda MIC-värdena för TTO var låga och låg mellan 0,06 % och 0,5 %. TTO:s antimikrobiella aktivitet tillskrivs huvudsakligen terpinen-4-ol, den viktigaste bioaktiva komponenten i TTO . De fastställda MIC-värdena för terpinen-4-ol var mycket låga, från 0,06 % till 0,25 %. Vår studie och andra studier visar att C. albicans inte uppvisar korsresistens mot TTO och azolmedel . Klinisk resistens mot TTO har inte rapporterats. TTO:s multikomponentkaraktär kan minska risken för att resistens uppstår spontant, och det kan krävas flera samtidiga mutationer för att övervinna alla de antimikrobiella verkningarna av var och en av komponenterna . TTO kan således användas som ett lokalt antiseptiskt medel för att effektivt behandla ytliga mykoser orsakade av flukonazolresistenta Candida spp. och andra azolresistenta jästsvampar. Tyvärr kan TTO vara potentiellt giftigt när det intas i höga doser, och därför bör TTO inte administreras oralt. Den akuta orala toxiciteten hos TTO liknar den orala toxiciteten hos andra vanliga eteriska oljor, t.ex. eukalyptusolja . TTO:s lipofila karaktär, som gör att den kan tränga in i hudens yttre skikt, förstärker inte bara den antiseptiska effekten utan också möjligheten till toxicitet på grund av hudabsorption. TTO kan orsaka hudirritation vid högre koncentrationer och kan ge upphov till allergiska reaktioner hos personer som är predisponerade för detta. Zhang och Robertson observerade ototoxisk effekt av 100 % TTO . TTO:s toxicitet är dosberoende, och de flesta biverkningar kan undvikas genom användning av TTO i utspädd form . TTO är inte mutagen eller genotoxisk .

Det finns ett ökande intresse inte bara för naturliga substansers aktivitet mot resistenta mikrober utan också för synergistiska interaktioner mellan dessa substanser och konventionella läkemedel . Flukonazol är ett av de azolantiskasvampmedel som används i stor utsträckning för både profylax och terapi av Candida-infektioner . I den här studien undersökte vi förändringar i flukonazols aktivitet mot flukonazolresistenta C. albicans-stammar efter exponering för subletala koncentrationer av TTO eller terpinen-4-ol. Vi använde uteslutande flukonazolresistenta stammar eftersom det skulle vara särskilt viktigt att identifiera synergistiska behandlingar för dessa stammar. Vi testade subletala koncentrationer av TTO och terpinen-4-ol eftersom vi förväntade oss att koncentrationer som är lägre än MIC skulle försvaga cellstrukturen utan att döda cellerna, vilket underlättar flukonazolens aktivitet och följaktligen hämmar C. albicans resistens mot flukonazol. Våra resultat visar att kortvarig (0,5 h) exponering av flukonazolresistenta C. albicans-stammar för subletala koncentrationer av TTO (1/4 MIC TTO) inte hade någon inverkan på flukonazols antimykotiska aktivitet. Exponering av C. albicans-celler för subletala koncentrationer av TTO och därefter behandling med flukonazol inhiberade dock resistensen mot flukonazol hos 87,5 % av de testade stammarna. Dessa resultat tyder på att det finns en synergistisk interaktion mellan flukonazol och TTO mot flukonazolresistenta C. albicans. TTO användes för att permeabilisera jästcellmembranen, vilket markant ökade känsligheten för flukonazol. TTO blir inbäddad i lipidbilagermembranet, vilket stör dess struktur, vilket leder till ökad permeabilitet och försämrad fysiologisk funktion. TTO hämmar också bildandet av groddrör eller mycelomvandling i C. albicans och hämmar andningen i C. albicans på ett dosberoende sätt. Svampceller som utsätts för TTO kommer så småningom att spricka. Subletala koncentrationer av TTO försvagar också Candida spp. cellernas vitalitet. Mekanismen för flukonazols svampdödande aktivitet är annorlunda. Det visades att flukonazol interfererar med det cytokrom P-450-beroende enzymet C-14α-demetylas, som ansvarar för produktionen av ergosterol. Störningen av ergosterolsyntesen orsakar strukturella och funktionella förändringar i svampens cellmembran, vilket predisponerar svampcellerna för skador. Hämning av cytokromoxidativa och peroxidativa enzymer är en ytterligare svampdödande aktivitet hos flukonazol . Flera mekanismer har beskrivits för flukonazolresistens hos isolat av C. albicans: ökad produktion av lanosterol 14α-demetylas som kodas av ERG11-genen och minskad affinitet hos lanosterol 14α-demetylaset för flukonazol på grund av mutationer i ERG11-genen och en defekt i Δ5-6-desaturaset som kodas av ERG3-genen, vilket leder till funktionsförlust i ergosterolvägen. Den andra mekanismen för flukonazolresistens hos C. albicans är den aktiva transporten av läkemedel över plasmamembranet med hjälp av ”effluxpumpar”, vilket kräver att CDR1/2- och MDR1-generna uttrycks . TTO-inducerad cellmembranskada kan störa funktionen hos ”effluxpumparna”, vilket gör svampcellen mer mottaglig för flukonazol .

Våra data visar att det finns en synergistisk effekt in vitro av subletala koncentrationer av TTO och flukonazol mot flukonazolresistenta C. albicans-stammar. Den flukonazolresistenta C. albicans ATCC 10231-standardstammen och fyra kliniska C. albicans-stammar ökade dock inte känsligheten för flukonazol. Skillnaderna i dessa stammars resistensmekanismer mot flukonazol var den troliga orsaken till denna effekt. I vår in vitro-studie var TTO:s huvudkomponent terpinen-4-ol mer aktiv än TTO och ökade kraftigt flukonazolaktiviteten mot alla studerade flukonazolresistenta C. albicans-stammar. Mondello et al. liksom Ninomiya et al. observerade att TTO och terpinen-4-ol in vivo var lika effektiva mot candidiasis orsakad av azolresistent C. albicans. De mekanismer som ligger till grund för synergin mellan flukonazol och TTO har inte klarlagts. Yu et al. bekräftade synergismen mellan flukonazol och triclosan mot kliniska isolat av flukonazolresistent C. albicans. Liu et al. observerade en synergistisk effekt mellan flukonazol och glabridin mot C. albicans som hänger samman med glabridins effekt på cellhöljet. Ahmad et al. beskrev synergistisk aktivitet av tymol och karvacrol tillsammans med flukonazol mot Candida-isolat. Båda monoterpenerna hämmade utflödet med 70-90 %, vilket visar deras höga potens för att blockera läkemedelstransportörpumpar.

I tidigare studier har man också utvärderat TTO:s aktivitet mot olika mikroorganismer i kombination med andra antimikrobiella substanser. En synergistisk effekt observerades för itrakonazol och TTO i en värmekänslig gel som används för att behandla vaginal candidiasis . Synergistiska effekter har också observerats mellan eteriska oljor och ciprofloxacin, gentamicin, cefixim och pristinamycin . I ett skivdiffusionstest med C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii och C. parapsilosis uppstod större tillväxthämmande zoner runt skivor som impregnerats med TTO och amfotericin B än runt skivor som endast innehöll TTO . I en studie av Staphylococcus aureus uppstod större zoner av tillväxthämning runt skivor impregnerade med TTO och andra eteriska oljor jämfört med skivor impregnerade endast med TTO .

Den synergistiska effekten av antimikrobiella ämnen har också visats med hjälp av tidsdödskurvor. Den korta förbehandlingen av Pseudomonas aeruginosa med en substans som bryter sönder cytoplasmamembranet (karbonylcyanid m-chlorfenylhydrazon, polymyxin B nonapeptid eller etylendiamintetraättiksyra) förstärkte TTO:s bakteriedödande aktivitet, vilket visades av den ökade hastigheten på mikrobernas avdödande effekt i time-killkurvorna . I en studie med E-testmetoden uppvisade dock Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus och koagulasnegativa stafylokocker (CoNS) som utsattes för subletala koncentrationer av TTO i 72 timmar ökad resistens mot gentamicin, streptomycin, kloramfenikol, tetracyklin, erytromycin, trimetoprim, ampicillin, fusidinsyra, mupirocin, linezolid och vankomycin. Ökad antimikrobiell aktivitet observerades när eteriska oljor kombinerades med deras isolerade komponenter (t.ex. terpinen-4-ol från Melaleuca alternifolia) och när TTO kombinerades med silverjoner .

Indexet för fraktionell hämningskoncentration (FIC), även kallat FICI, används för att avgöra om två ämnen är synergistiska eller antagonistiska. FIC-värden kan tolkas på olika sätt, men i allmänhet tyder ett FIC-index lägre än 0,5 på synergism och ett FIC-index högre än 4 på antagonism . FIC-indexvärdet för TTO och tobramycin var 0,37 för Escherichia coli och 0,62 för Staphylococcus aureus, vilket tyder på att dessa två ämnen är synergistiska . En mindre synergistisk effekt observerades vid behandling av Candida albicans med TTO och amfotericin B och Klebsiella pneumoniae med TTO och ciprofloxacin. TTO och ciprofloxacin uppvisar antagonistiska effekter mot Staphylococcus aureus . Det finns ingen synergistisk effekt mellan TTO och lysostafin, mupirocin, gentamicin eller vankomycin mot meticillinresistenta Staphylococcus aureus-stammar. Faktum är att FIC-indexet visade att TTO och vankomycin är antagonistiska .

Resultaten av denna studie och andra tidigare studier visar att kombinationen av naturliga ämnen som TTO och konventionella läkemedel som t.ex. flukonazol kan hjälpa till att behandla svåra jästinfektioner. Ytterligare in vitro-studier behövs dock för att identifiera den antimikrobiella aktiviteten hos naturliga läkemedelssubstanser och upptäcka synergistiska interaktioner med vanligt förekommande antimikrobiella medel.

Interessentkonflikter

Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt gällande publiceringen av denna artikel.

Ackord

Författarna vill tacka företaget MELALEUCA i Gliwice (Polen) för att de vänligen donerat den australiensiska tea tree-oljan som erhållits från Melaleuca alternifolia, företaget Polfarmex i Kutno (Polen) för att de vänligen donerat flukonazol och LABOMED Microbiological Laboratory i Gliwice (Polen) för att de vänligen ställt de kliniska Candida albicans-stammarna till förfogande som använts i den här studien.