Genommontering och annotering av maneter

Här presenterar vi den första de novo-genommonteringen av Nomura-maneten (Nemopilema nomurai; Fig. 1b). Den resulterade i ett 213 Mb stort genom bestående av 255 scaffolds och en N50-längd på 2,71 Mb, med endast 1,48 % luckor (Additional file 1: Tabellerna S2 och S3). Nemopilema-hybridsamlingen skapades med hjälp av en kombination av sekvenseringstekniker med korta och långa läsningar, bestående av 38,2 Gb Pacific Biosciences (PacBio) single-molecule real-time sequencing (SMRT) läsningar, tillsammans med 98,6 Gb Illumina short-insert, mate-pair, och TruSeq syntetiska långa läsningar (Additional file 1: Figures S3-S5; Tables S4-S7). Den resulterande sammansättningen visar den längsta kontinuiteten bland cnidarianernas genomer (Additional file 1: Table S9). Vi förutspådde 18 962 proteinkodande manetgener genom att kombinera de novo (med hjälp av transkriptom av medusaklocka och tentakelvävnad) och homologa genförutsägelsemetoder (Additional file 1: Tabellerna S10 och S11, Additional files 2 och 3). Genom denna process återfanns det högsta antalet ortologiska gener med enkelkopiering bland alla hittills publicerade sammansättningar av genomer från icke-bilateriska metazoer (Additional file 1: Table S12). Totalt 21,07 % av manetens genom visade sig bestå av transposerbara element, jämfört med Acropora digitifera (9,45 %), Nematostella vectensis (33,63 %) och Hydra vulgaris (42,87 %) (Additional file 1: Table S13).

Vi jämförde Nemopilema-genomet med andra genomer från nässeldjur, inklusive de nyligen publicerade genomerna från Aurelia aurita och Clytia hemisphaerica , som alla kommer från övervägande fastsittande taxa, för att upptäcka unika Scyphozoa-funktioner (aktiv rörlighet), fysisk struktur (medusaklocka) och kemi (gift). Vi utförde också transkriptomanalyser av både Nemopilema nomurai och Sanderia malayensis-maneter över tre medusavävnadstyper och fyra utvecklingsstadier.

Evolutionär analys av maneter

För att identifiera manetspecifika evolutionära drag undersökte vi genfamiljsexpansioner och -kontraktioner över en encellig holozoan och 13 metazoanerna med hjälp av 18 458 ortologa genfamiljer (se Additional file 1: avsnitt 4.1). Av dessa hittades 10 434 i Nemopilema och 6764 delades av alla tre tillgängliga nässeldjursklasser (Scyphozoa: Nemopilema nomurai och Aurelia aurita; Hydrozoa: Hydra vulgaris , Clytia hemisphaerica; Anthozoa: Acropora digitifera och Nematostella vectensis ; fig. 2a). En fylogeni som konstruerades med hjälp av dessa ortologer avslöjade en monofyletisk cnidarian-klad som skiljde sig från metazoernas stam innan de bilaterala organismerna utvecklades (fig. 2b; Additional file 1: Figure S7). För att fastställa hur många gener som dök upp under varje evolutionär epok i Nomuras maneters genom utvärderade vi också den evolutionära åldern för de proteinkodande generna. Genom att gruppera manetgener i tre breda evolutionära epoker observerade vi att medan majoriteten (80 %) av generna är gamla (äldre än 741 Mya), är några få (~ 3 %) av en medelålder (741-239 Mya), och några (17 %) är unga (239 Mya till nutid; Fig. 2c; Additional file 1: Figure S10). Intressant nog tyder en normalisering av antalet gener med åldern och längden på den evolutionära eran på att genomsättningen är som störst nära den nuvarande tiden. Totalt innehöll Nemopilemas genom 123 expanderade och 164 sammandragna genfamiljer jämfört med Nemopilemas och Aurelias gemensamma förfader (Fig. 2b; se Additional file 1: avsnitt 4.2). Gene Ontology (GO)-termer relaterade till sensorisk perception var underrepresenterade i Cnidaria-linjen jämfört med Bilateria, vilket exakt återspeglar cnidarias mindre komplexa sensoriska system (Additional file 1: Tabellerna S14 och S15). Neurotransmittortransport (GO:0006836, P = 6,01E- 10) var dock signifikant anrikad i Scyphozoa-släktet jämfört med den gemensamma förfadern till Scyphozoa och Hydrozoa (Additional file 1: Tabellerna S16 och S17), vilket troligen beror på de balans- och visuella strukturerna, t.ex. statocystan och ocelli, som är mer utarbetade i den rörliga medusan än i de fastsittande polyperna . Jämfört med den gemensamma förfadern till Nemopilema och Aurelia uppvisade Nemopilema utökade genfamiljer associerade med metallopeptidasaktiviteter (GO:0008237, P = 2,86E- 14; Additional file 1: Tabellerna S18 och S19). Dessutom hittade vi 1589 ortologiska genfamiljer som är specifika för Scyphozoa. Anrikningstester av Scyphozoa-specifika gener visade termerna natriumjontransport, jonkanalaktivitet och neurotransmittorreceptoraktivitet (Additional file 1: Table S20).

Genomisk kontext och muskelassocierade gener

Maranjurar har två primära muskeltyper: De epitelomuskulära cellerna, som är de dominerande muskelcellerna som finns hos fastsittande nässeldjur, och de strimmiga muskelcellerna som finns i medusaklockan och som är viktiga för simning. För att förstå evolutionen av aktiv simning hos maneter undersökte vi deras kodonbias jämfört med andra metazoer genom att beräkna guanin- och cytosininnehållet vid den tredje kodonpositionen (GC3) (Additional file 1: Figur S13). Det har föreslagits att gener med hög GC3-halt är mer anpassningsbara till yttre påfrestningar (t.ex. miljöförändringar) . Bland de 100 högst rankade GC3-biaserade generna, regleringen av muskelkontraktion och neuropeptidsignalvägar var GO-termerna specifika för Nemopilema (Additional file 4: Tabellerna S25 och S26). Kalcium spelar en nyckelroll i den streckade muskelkontraktionen hos maneter, och kalciumsignalvägen (GO:0004020, P = 5,60E- 10) uppvisade en hög nivå av GC3-bias som var specifik för Nemopilema. Nemopilema och Aurelias 500 bästa GC3-gener var berikade i GO-termer associerade med homeostas (t.ex, cellulär kemisk homeostas och natriumjontransport), vilket vi spekulerar i är viktigt för aktivering av muskelkontraktioner som driver manetens mobila predation (Additional file 1: avsnitt 5.1; Additional file 4: tabellerna S27 och S28).

Då nässeldjur har rapporterats sakna titin- och troponinkomplex, som är kritiska komponenter i bilaterala streckade muskler, har det föreslagits att de två kladerna självständigt utvecklat streckade muskler . En undersökning av gener som kodar för muskelstrukturella och regulatoriska proteiner hos nässeldjur visade att det finns en bevarad eumetazoisk kärna av aktin-myosin-kontraktilt maskineri som delas med bilaterala djur (Additional file 1: Table S32). I likhet med andra nässeldjur saknar Nemopilema dock titin- och troponinkomplex, som är nyckelkomponenter i bilaterala streckade muskler. Dessutom saknades γ-syntrofin, en komponent i dystroglykan-komplexet, i Nemopilema, Aurelia och Hydra. Nemopilema och Aurelia har dock α/β-Dystrobrevin och α/ε-Sarcoglycan dystroglykanassocierade costamereproteiner, vilket tyder på att flera komponenter i dystroglykankomplexet gick förlorade efter splittringen mellan Scyphozoa och Hydrozoa. Det föreslogs att Hydra genomgått sekundära förenklingar i förhållande till Nematostella, som har en högre grad av specialisering av muskelcellstyp . Jämfört med Hydra och Nematostella uppvisar Nemopilema och Aurelia en mellanliggande komplexitet av muskelstrukturella och regulatoriska proteiner mellan Hydra och Nematostella.

Transkriptomprofilering av medusaklocka och tentakel

Maranens medusaklocka och tentakel är morfologiskt distinkta och utför skilda fysiologiska funktioner . Vi genererade transkriptom av klocka och tentakel från Nemopilema och den mindre Sanderia malayensis, som kan odlas i laboratoriet, för att bedöma utvecklingsreglering (Additional file 1: Table S29). Anrikningstester av högt uttryckta gener visade att muskelassocierade funktionskategorier (t.ex. muskelmyosinkomplex och muskelvävnadsmorfogenes) var anrikade i klockan (Fig. 3a; Additional file 5: Tabeller S30-S33). Myosiner utgör en superfamilj av motorproteiner och spelar en kritisk roll i muskelkontraktion och är involverade i ett stort antal motilitetsprocesser hos eukaryoter. Det är framför allt proteinerna i Myosin II-familjen, som finns i celler i både strimmig muskelvävnad och slät muskelvävnad, som är ansvariga för att producera sammandragning i muskelceller . Nötdjur har både epitelomuskulära celler och streckade muskelceller. Den streckade muskeln är en viktig komponent i medusaklockans subumbrella, där dess snabba sammandragningar ger upphov till manetens unika framdrivningsbaserade simning. Vi fann att genfamiljerna typ II Myosin heavy chain (MYH) och Myosin light chain (MYL) var starkt uttryckta i klockan och är nära förknippade med strimmiga och glatta muskelceller . Intressant nog uppvisade Nemopilema och Aurelia det största antalet kopior av MYH- och MYL-gener bland icke-bilateriska metazoer (Fig. 3c; Additional file 1: Figures S14-S17; Tabeller S38-40), och sex av de sju MYH-generna och 12 av 21 MYL-gener i Nemopilema uppvisade ett högre uttryck i klockan än i tentaklerna med en mycket hög ~ 8,8 och ~ 17-faldig ökning i genomsnitt, respektive (Fig. 3d). Dessa resultat tyder på att kombinationerna av expansion av antalet kopior av typ II Myosin genfamiljer och högt uttryck av muskelassocierade gener bekräftade att musklerna i medusaklockan är en viktig bestämningsfaktor för manetens motilitet.

Tvärtom avslöjade genuttrycksanalyser av tentaklarna höga RNA-uttrycksnivåer av neurotransmittor-associerade funktionella kategorier (jonkanalkomplex, postsynaps och neurotransmittoreceptoraktivitet; fig. 3b; Additional file 5: Tabeller S34-S37), vilket stämmer överens med anatomin hos manetters tentakler, som innehåller sensoriska celler och ett löst plexus av den neuronala subpopulationen vid basen av ektodermen .

Kroppsmönster hos maneter

Det har funnits mycket diskussion kring den tidiga utvecklingen av kroppsmönster hos metazoernas gemensamma förfader, särskilt när det gäller ursprunget och expansionen av Hox- och Wnt- genfamiljerna . Totalt hittades 83 homeodomäner i Nemopilema, medan 82, 41, 120 och 148 homeodomäner hittades i Aurelia, Hydra, Acropora respektive Nematostella (Additional file 1: Table S41). Fem av de åtta Hox-generna i Nemopilema är av den posteriora typen som är förknippade med utvecklingen av den aborala axeln och klustrade med Nematostellas posteriora Hox-gener, HOXE och HOXF (Additional file 1: Figures S18-S20). Aurelia har sex Hox-gener av posteriortyp, men saknar HOXB-, C- och D-typen (HOX2 hos människor). Även om de saknas i Hydra och Acropora visar syntesanalyser av ParaHox-gener i Nemopilema att XLOX/CDX-genen är belägen omedelbart nedströms GSX i samma tandemorientering som hos Nematostella, vilket tyder på att XLOX/CDX fanns i njurarnas gemensamma förfader och därefter försvann i vissa släktled (Additional file 1: Figur S21). Hox-relaterade gener, EVX och EMX, finns också i Nemopilema och Aurelia, även om de saknas i Hydra. Med tanke på den stora mängden ancestral mångfald i Wnt-generna har det föreslagits att Wnt-signalering styrde kroppsplansutvecklingen i de tidiga metazoerna . Nemopilema har 13 Wnt-ortologer som representerar 10 Wnt-subfamiljer (Additional file1: Figur S22; Tabell S42). Wnt9 saknas i alla cnidarier, vilket troligen representerar förluster i cnidariernas gemensamma förfader. Nötdjur har genomgått dynamiska linjespecifika duplikationer av Wnt-subfamiljen, t.ex. Wnt8 (Nematostella, Acropora och Aurelia), Wnt10 (Hydra), Wnt11 och Wnt16 (Nemopilema och Aurelia). Det har föreslagits att ett gemensamt kluster av Wnt-gener (Wnt1-Wnt6-Wnt10) fanns hos den sista gemensamma förfadern till leddjur och deuterostomer . Våra analyser av genomet hos nässeldjur och bilaterala djur visade att Acropora också har detta kluster, medan Nemopilema, Aurelia och Hydra saknar Wnt6, vilket tyder på att Wnt6-genen har försvunnit hos Medusozoas gemensamma förfader (Additional file 1: Figur S23). Sammantaget har maneterna ett jämförbart antal Hox- och Wnt-gener som andra nässeldjur, men den dynamiska repertoaren av dessa genfamiljer tyder på att nässeldjuren har utvecklats oberoende av varandra för att anpassa sina fysiologiska egenskaper och sin livscykel.

Övergången från polyp till medusa hos maneter

Övergången från polyp till medusa är framträdande hos maneterna jämfört med de andra fastsittande nässeldjuren. För att förstå den genetiska grunden för bildandet av medusastrukturen hos maneter jämförde vi transkriptionsregleringen mellan nässeldjur och mellan olika utvecklingsstadier hos maneter (se Additional file 1: avsnitt 7.1 och 7.2). Vi sammanställde Sanderia-transkriptionerna med hjälp av sex samlade prover av transkriptom (Additional file 1: Table S43). De sammansatta transkriptionerna hade en total längd på 61 Mb och resulterade i 58 290 transkriptisoformer och 43 541 unika transkriptioner, med en N50 på 2325 bp. I genomsnitt 87 % av RNA-avläsningarna anpassades till de sammansatta transkriptionerna (Additional file 1: Table S44), vilket tyder på att transkriptionssammansättningen representerade majoriteten av de sekvenserade avläsningarna. Dessutom var sammansättningen av de proteindomäner som ingick i de 20 bästa leden ganska likartad mellan Nemopilema och Sanderia (Additional file 1: Table S45). För att få fram differentiellt uttryckta gener för varje stadium jämförde vi varje stadium med föregående eller nästa stadium i manetens livscykel. Polypstadiet, som representerar ett fastsittande stadium i manetens livscykel, uppvisade berikade termer relaterade till jonkanalaktivitet och energimetabolism (reglering av metabolisk process och metabolisk process för aminosocker; Additional file 1: Table S46). Aktivt ätande i polypen stimulerar asexuell spridning antingen till fler polyper eller metamorfos till strobila . Eftersom antozoer inte bildar en medusa är strobilas asexuella reproduktionsstadium ett viktigt stadium för att studera metamorfosen från polyp till medusa. I detta stadium var GO-termer relaterade till biosyntetisk och metabolisk process för amider högt uttryckta jämfört med polypstadiet (Additional file 1: Table S47). Det har rapporterats att RF-amid och LW-amid neuropeptider var förknippade med metamorfos hos nässeldjur . Vi kunde dock inte bekräfta detta fynd i våra jämförelser av strobila och ephyra-stadier. I vårt system är genuttrycksmönstren i de två stadierna ganska lika. I ephyra, det frigjorda rörliga stadiet, var GO-termer som involverar amidbiosyntetisk och metabolisk process också högt uttryckta jämfört med det sammanslagna medusastadiet (Additional file 1: Tabell S48). I medusa anrikades termer för extracellulär matris, metallopeptidasaktivitet och immunsystemprocesser (Additional file 1: Table S49), vilket stämmer överens med fysiologin hos deras vävnadstyper klocka, tentakler och munarm.

Polyp-till-medusa-metamorfos visades tidigare vara starkt förknippad med CL390- och retinoid X-receptor-(RXR)-gener i maneten Aurelia aurita . Intressant nog hittades CL390 inte i Nemopilema eller andra publicerade nässeldjur, vilket tyder på att det kan vara en Aurelia-specifik strobilationsinducerande gen. Vi bekräftar dock att RXR finns i Nemopilema och saknas hos nässeldjur utan medusastadium (Additional file 1: Figur S24). Retinsyra (RA)-signalering spelar en central roll under tillväxt och utveckling hos ryggradsdjur , där den reglerar transkriptionen genom att interagera med RA-receptorn (RAR) som är bunden till RA-svarselement (RAREs) i närliggande målgener . Av generna i RA-signalvägen har Nemopilema ADH- och RALDH-enzymer som metaboliserar retinol till RA, och RXR och RAREs för att aktivera transkriptionen av målgenen (fig. 4a). Vi upptäckte 1630 Nemopilema RARE-regioner med ett genomsnittligt avstånd på 13 Kbp till den närmaste genen (Fig. 4b; Additional file 1: Tabellerna S50 och S51). Intressant nog var fyra bakre Hox-gener från Nemopilema och två Hox-gener från Aurelia belägna inom ± 10 Kbp från RARE-regioner, vilket är unikt bland de icke-bilateriska metazoerna (Fig. 4c; Additional file 1: Table S52). Tillsammans tyder dessa fynd på att retinosyra-signalering fanns i tidiga metazoer för att reglera målgener med RXR och RAREs och att RXR och RAREs kan spela en kritisk roll för metamorfos från polyp till medusa .

Identifiering av toxin-relaterade domäner i maneter

Mareller producerar komplexa blandningar av proteinhaltiga gifter för att aktivt fånga och försvara byten. Vi identifierade rikliga toxin domäner i Nemopilema när vi jämförde med de icke-bilateriska metazoerna genuppsättningar i Tox-Prot databasen . Totalt 67 av 136 toxindomäner anpassades till icke-bilateriska metazoer. Av dessa 67 toxindomäner återfanns 52 i Nemopilema (Additional file 1: Table S53). Som väntat innehåller Nemopilema-genomet det största antalet gift- eller toxinassocierade domäner av de inkluderade icke-bilateriska metazoerna. Dessa domäner inkluderar Zinkmetalloproteas (PF01421) från Reprolysinfamiljen (M12B), fosfolipas A2 (PF05826) och Prokineticin (PF06607) (fig. 5). Nemopilema och Aurelia har också 8 respektive 11 ShK-domänliknande (PF01549) domäner, som är de vanligaste hos dessa arter jämfört med andra icke-bilaterianer. Zinkmetalloproteaser i Reprolysin (M12B)-familjen är enzymer som klyver peptider och omfattar de flesta endopeptidaser i ormgift . Vidare har det rapporterats att serinproteasinhibitor- och ShK-domäner har hittats rikligt i transkriptomerna hos både kanonkulemaneter (Stomolophus meleagris) och boxmaneter (Chironex fleckeri), och fosfolipas A2 är ett välkaraktäriserat toxinrelaterat enzym, som är kritiskt för produktionen av giftkomponenter, och som återfinns i klassen Scyphozoa .

.