Canine leishmaniasis (CanL) är en protozoisk infektion/sjukdom som orsakas av Leishmania infantum (synonymer: Leishmania chagasi; Leishmania infantum chagasi) som är mycket utbredd i alla länder i Medelhavsområdet, Kaukasien och Mellanöstern i den gamla världen samt i flera latinamerikanska områden (Dantas-Torres et al., 2012). Infektionsutfallet hos hundar varierar från subklinisk till klinisk och från mild till allvarlig sjukdom. Även om parasiten ibland kan överföras på icke-vektoriella sätt (EFSA:s panel för djurs hälsa och välbefinnande, 2015) är den huvudsakliga överföringsvägen genom bett från infekterade flebotominsandflugor. Från cirka 7 dagar efter en infekterad blodmåltid kan kompetenta vektorer utveckla infektiva Leishmania promastigoter i förloppet, som regurgiteras in i däggdjursvärdens hud under den efterföljande blodmåltiden (Bates, 2007). Både subkliniska och sjuka hundar kan vara smittsamma för vektorer; sannolikheten för att de bidrar oproportionerligt mycket till den fortsatta överföringen (”superspridareffekt”) ökar dock med varaktigheten och svårighetsgraden av CanL (Courtenay et al., 2014).

Phlebotomus perniciosus är den viktigaste kompetenta vektorn för L. infantum i hela västra Medelhavsområdet, inklusive södra Europa och nordvästra Afrika (Europeiskt centrum för förebyggande och kontroll av sjukdomar, 2019). Dessutom är P. perniciosus en representativ medlem av en större taxonomisk grupp, Larroussius subgenus, som består av morfologiskt, genetiskt och biologiskt närbesläktade arter som agerar som kompetenta vektorer av L. infantum i centrala och östra Medelhavet, såsom Phlebotomus neglectus och Phlebotomus tobbi (Alten et al., 2016). Användningen av topiska pyretroider anses allmänt vara förstahandsmetoden för att skydda friska hundar från Leishmania-infekterade sandfly-bett (Maroli et al., 2010), medan hanteringen av infekterade/infektiösa hundar är en komplicerad uppgift på grund av avsaknaden av ett brett samförstånd när det gäller vilken metod som ska användas. Helst bör individuell veterinärvård för hantering av CanL-patologi kombineras med åtgärder som syftar till att förhindra att parasiten sprids via vektorn. Det sistnämnda är särskilt viktigt som en del av de program för bekämpning av zoonotisk VL som för närvarande genomförs i flera endemiska länder. Å ena sidan är ägarna ovilliga att investera i pyretroidprodukter för hundar som redan är infekterade eller sjuka, å andra sidan har antileishmaniala terapier endast tillfällig effekt för att konsekvent minska en hunds smittsamhet mot sandflugor (Miró et al., 2017). Isoxazoliner är en ny klass av föreningar som riktar sig mot det centrala nervsystemet och neuromuskulära korsningar hos leddjursvektorer genom att blockera ligandstyrda kloridkanaler, vilket leder till att leddjuren dör (Weber & Selzer, 2016). Ett antal föreningar har godkänts som veterinärmedicinska läkemedel för skydd av sällskapsdjur mot loppor och fästingar, med långa halveringstider in vivo som ger veckor till månader av skydd efter en enda oral administrering (Kilp et al., 2014; Shoop et al., 2014). Dessa egenskaper väckte uppmärksamhet för den potentiella användningen av isoxazoliner för kontroll av vektorburna sjukdomar hos människor (Miglianico et al., 2018). När det gäller flygande insekter visade sig både graden och varaktigheten av insekticid effekt skilja sig mellan kommersiellt tillgängliga isoxazolinläkemedel när de administrerades till hundar, t.ex. mot Triatoma infestans (Loza et al., 2017) eller sandflugan Phlebotomus papatasi (Gomez et al., 2018a), där fluralaner (Bravecto®; Merck Animal Health) visade sig vara den mest aktiva föreningen när det gäller de ovan nämnda effektparametrarna. Nyligen användes i en klinisk prövning av fluralanerbehandling av hundar mot sandflugor koloniserade P. papatasi som målart (Gomez et al., 2018b). Denna art kan dock inte anses vara en lämplig sandflugmodell. Detta beror främst på att P. papatasi inte är en kompetent vektor av L. infantum, eftersom den är refraktär mot tarmutveckling av denna parasit. Dessutom tyder tidigare studier på topiska pyretroider för hundar (Maroli et al., 2010) på att P. papatasi kan vara mindre mottaglig för föreningar som är inriktade på sandflugans centrala nervsystem än P. perniciosus. Till exempel dödade en spot-on-formulering av 50 % permetrin-10 % imidakloprid 29 % av P. papatasi jämfört med 49 % av P. perniciosus. Dessa överväganden föranledde oss att bestämma hur lång insekticid effekt mot P. perniciosus som börjar och varar efter utfodring av fluralanerbehandlade hundar.

En parallellgruppsutformad, negativt kontrollerad, randomiserad, blindad, encentrerad effektstudie utfördes. Försökshundar, bestående av manliga Beagles ≥ 6 månader vid inklusionstillfället, kom från en forskningskoloni i Mohammedia, Marocko; studien i livsfasen genomfördes vid Clinvets anläggningar. Vuxna P. perniciosus-exemplar kom från en spansk stam som från och med juni 2012 och framåt hölls vid de medicinska entomologiska anläggningarna vid Istituto Superiore di Sanità, Italien, vid 28 ± 1 °C och 75-80 % relativ luftfuktighet. Sandflugorna certifierades för patogenfri status och anpassades till massuppfödningsförhållanden med sex oberoende koloniunderlinjer. Tre till nio dagar gamla exemplar samlades från respektive framväxande burar och fördelades i liknande åldersförhållanden i cylindriska plastkrukor (400 ml) försedda med ett tätt lock, som var perforerat och hålet täckt med en fin gasbinda som innehöll en bomullsbit som var indränkt med glukosmättad lösning. Antalet sandflugor i varje kruka var tillräckligt för en hund, med tillägg av några extra exemplar för att kompensera för dödsfall som inträffade före försöken. Krukorna sattes i lufttäta plastpåsar försedda med fuktat filterpapper. Den sekundära förpackningen bestod av en förvärmd behållare försedd med en förlängd temperaturstabilitetsanordning och en digital temperaturregistrerare, omgiven av en robust kartonglåda. Lådorna skickades till Marocko med flyg och leveransen skedde ungefär inom tre dagar efter avsändningen. Vid leveransen kontrollerades temperaturregistreringen och plastpåsarna lämnades oöppnade vid 25 ± 3 °C i väntan på att hundarna skulle exponeras. En grov bedömning av sandflygdödligheten i krukorna gjordes utifrån, och en dödlighet på ≤ 10 % per kruka ansågs acceptabel för användning. I slutändan, vid tidpunkten för experimenten, exponerades varje hund för samma homogena population av sandflugor som åldras 7-14 dagar.

Tjugosju dagar före behandlingen sövdes 14 manliga Beaglehundar med Domitor® (Vetoquinol, Lure, Frankrike) och deras huvud utsattes under en timme för bett från cirka 40 burna P. perniciosus-honor, tillsammans med fem hanar för att främja bettbeteendet, i syfte att bedöma individens attraktionskraft för vektorn under dessa försöksförhållanden. Hundarna rangordnades i fallande ordning på grundval av antalet levande blodmatade exemplar. Två hundar med det lägsta antalet exkluderades från studien, och tolv hundar inkluderades och fördelades på två grupper om sex hundar vardera (grupperna 1 och 2). På dag 0 behandlades hundar i grupp 2 med en oral dos fluralaner (Bravecto® tuggtabletter) i en märkt dosering på 25-56 mg/kg kroppsvikt, medan hundar i grupp 1 förblev obehandlade. Särskilda hälsoobservationer utfördes 1, 2 och 6 timmar efter fluralaneradministrationen till den sista hunden. Exponeringen av hundar för cirka 40-60 P. perniciosus-honor (plus 5-10 hanar) utfördes parallellt för båda grupperna, vid liknande temperatur- och luftfuktighetsförhållanden i två rum, dagarna 1, 28 och 84 (en mellanliggande bedömning övervägdes ursprungligen för perioden cirka 50-60 dagar efter behandlingen, men detta var inte möjligt på grund av tekniska och logistiska problem). Det primära kriteriet för fastställande av effekt var överlevnaden hos sandflugor som fått fullfoder av behandlade hundar jämfört med dem som fått fullfoder av kontrollhundar, och delvis eller marginellt blodmatade exemplar beaktades inte. För att möjliggöra optimala och hållbara jämförelser mellan de två grupperna av sandflugexemplar samlades honorna individuellt från exponeringsburarna genom försiktig munsugning och samlades i grupper om ≤ 10 exemplar i gipsfodrade plastkrukor. Krukorna placerades sedan i lådor med mättad glukos och fuktat filterpapper och hölls därefter vid 26 °C. Livskraftsbedömningar utfördes efter 6 timmar (utom dag 1) och därefter med 24 timmars intervall upp till högst 96 timmar efter avslutad exponering. För att bedöma den allmänna livskraften hos de sandflugor som användes i varje experiment tillämpades de ovan beskrivna förfarandena på både matade och omatade honor.

Den statistiska betydelsen av resultaten av den insekticida effekten, uttryckt som andelen levande matade sandflugor från grupp 2 jämfört med dem från grupp 1, beräknades med hjälp av en linjär blandad modell som inkluderade undersökningsgruppen som en fast effekt och ett randomiseringsblock som en slumpmässig effekt, med signifikansnivån satt till α = 0,05 (dubbelsidig). Modellen använde Kenward-Rogers justering för att bestämma frihetsgraderna i nämnaren.

Dag 1 utvärderades 78 blodmatade prover av totalt 159 levande honor som samlats in från hundar i grupp 2 jämfört med 64 blodmatade prover/169 levande honor från hundar i grupp 1. På dag 28 var 199/341 levande tikar från grupp 2 blodmatade och utvärderades jämfört med 146/310 från grupp 1. På dag 84 var 240/326 blodmatade exemplar från grupp 2 respektive 206/339 från grupp 1 blodmatade. Tabell 1 visar de genomsnittliga andelarna av överlevande P. perniciosus efter att ha tagit en blodmåltid på behandlade och obehandlade hundar. Dag 1 efter behandlingen fanns det tecken på några dödsfall bland de svullna sandflugorna redan vid insamlingstillfället från exponeringsburarna i grupp 2, men inte bland dem i grupp 1. Efter 24 timmar var alla blodmatade exemplar från grupp 2 döda, vilket kan jämföras med 11 % av de blodmatade exemplaren från grupp 1. Dag 28 var överlevnaden hos de exemplar som matats med hundar från grupp 2 betydligt lägre än hos dem från grupp 1 redan 6 timmar efter blodmålet. Återigen var alla blodmatade exemplar från grupp 2 döda efter 24 timmar, till skillnad från 3 % av de blodmatade exemplaren från grupp 1. På dag 84 överlevde ett antal exemplar som hade ätit av behandlade hundar till slutet av observationerna, med stora variationer inom grupperna. Deras överlevnadsgrad minskade från och med 24 timmar och var betydligt lägre från och med 48 timmar jämfört med exemplar som ätit av kontrollhundar, med en beräknad insektsdödande aktivitet på över 50 % fram till 96 timmars observation.

Överlevnadsfrekvensen av ofödda sandflugor som samlats in från exponeringsburarna utvärderades också upp till 96 timmar efter varje hunds exponering. De var generellt sett förhöjda och högre jämfört med dem i blodmatade exemplar, och visade vissa skillnader mellan varje dag av en hunds exponering, även om de inte var så stora mellan försöksgrupperna i varje exponering. Detta kan avspegla variationer från parti till parti i mortalitet som vanligtvis förekommer mellan generationer av koloniserade sandflugor, och möjligen olika transportförhållanden. Blodintag var den enda variabel som var förknippad med 100 % sandflygdödlighet hos fluralanerbehandlade hundar (fig. 1).

Denna studie, som visserligen inte jämför olika sandflygarter, ger ytterligare bevis för att känsligheten för insekticidprodukter för hundar som är inriktade på sandflygets centrala nervsystem kan vara högre hos P. perniciosus än hos P. papatasi. Genom att använda samma fluralanerformulering och doser i en studie som inkluderade Beagles som exponerades för denna art, registrerade Gomez et al. (2018b) partiell överlevnad av blodmatade P. papatasi-honor (i storleksordningen 6-7 %) redan 17-31 dagar efter behandling, vilket ökade till cirka 25 % vid dag 45.

Det finns > 5 dagars fördröjningstid för en sandfluga att bli smittsam efter att ha fått i sig ett infekterat blodmål. Det finns därför en teknisk utmaning för studier av systemiska insekticider på sandflugor när det gäller att upprätthålla en hög och varaktig överlevnad hos blodmatade kontrollprover och att upptäcka eventuella fördröjda insekticidala effekter som fortfarande har en överföringsblockerande potential. Denna utmaning skiljer sig från de vanligaste studierna med behandlingar som förhindrar födointag, där sandflugorna dödas av operatörerna omedelbart efter det att hunden utsatts för exponering och poängsätts som blodfödda/icke-födda. Det krävs långsiktiga utvärderingar för att säkerställa en meningsfull tolkning och statistisk signifikans av skillnaderna i överlevnad mellan behandlade grupper och kontrollgrupper (t.ex. under den nedåtgående fasens koncentrationer av läkemedel i hundplasman). Användningen av ex vivo hundblod från både behandlade och kontrollhundar i konstgjorda utfodringssystem kan vara känsligt för bakteriell kontaminering och därmed resultera i snabb död av alla engorgade sandflugor, vilket endast tillåter ett smalt tidsmässigt fönster för att särskilja mellan aktiva och icke-aktiva läkemedel (Gomez et al., 2018a). I den aktuella studien var överlevnaden hos de blodmatade kontrollproverna mycket tillfredsställande, med ett intervall på 61-81 % vid 96 timmar efter blodmåltiden.

Farmakokinetiken för fluralaner i hundplasma efter en enda oral administrering visade en regelbunden nedåtgående trend fram till cirka 100 dagar efter behandlingen, då den blir odetekterbar (Kilp et al., 2014). Det är intressant att notera att ett teoretiskt medelvärde på cirka 40-100 ng fluralaner/mL plasma, motsvarande 84 dagar efter behandling, fortfarande kunde döda > 50 % av P. perniciosus inom 48 timmar efter ett blodmål. Därför är det troligt att även intermediära plasmakoncentrationer, t.ex. de som förväntas mellan 28 och 84 dagar efter behandling, ger förhöjd insekticid aktivitet mot vektorn, och därför behövs nya studier för att bekräfta detta. Å andra sidan visar resultaten av den aktuella studien med avseende på de tre tidpunkterna tydligt en sammanhängande trend av minskad effekt under hela studien.

Slutsatsen är att fluralanerbehandling av hundar utgör en lovande metod för att minska poolen av infekterade vektorer i endemiska miljöer med zoonotisk VL. Dessutom kan användningen av fluralaner i kombination med förebyggande topiska pyretroidbehandlingar, förutsatt att detta inte är kontraindicerat för hundens säkerhet (Walther et al., 2014), ge fördelar för hundar i högriskområden.