Introduktion

Närvaron av kotor är ett utmärkande drag för ryggradsdjurens kroppsplan. Ett kotskelett kan bestå av en serie parvisa neuralbågar som täcker ryggmärgen, parvisa hemalbågar som omsluter den kaudala artären och venen och, hos många käkande ryggradsdjur (gnathostomer), en serie centra som ersätter notochordet som den förhärskande stödstrukturen. Kotcentra är mycket varierande när det gäller morfologi och vävnadssammansättning och har troligen utvecklats oberoende av varandra i många olika släktled hos gnathostomer, inklusive tetrapoder, teleostfiskar och broskfiskar . Denna uppenbara evolutionära konvergens väcker frågor om det embryonala ursprunget av vertebrala skelettelement i alla gnathostomer.

I tetrapoder härstammar alla komponenter i det vertebrala skelettet från somiter: tillfälliga, bilaterala block av segmenterad paraxial mesoderm som bildas dorsalt i den embryonala bålen. Somiterna är uppdelade i dorsala och ventrala subdivisioner som ger upphov till bindevävnad och muskulatur i bålen (”dermomyotom”) respektive skelettvävnad (”sklerotom”). Experiment för att spåra cellinjerna med hjälp av chick-quail chimärer och fluorescein-dextraninjektioner eller transplantat från GFP-transgena donatorembryon i axolotl har visat att ryggradsskelettet hos dessa taxa har ett helt somitiskt ursprung, med somitiskt härstammande celler som återfinns i utvecklande bågar och begynnande brosk i centra.

I motsats till detta tycks ryggradsskelettet hos teleostfiskar med strålfenor ha ett dubbelt embryonalt ursprung, med bidrag från både paraxial mesoderm och notochordet. Teleosters kotcentrum består av ett inre skikt (chordacentrum) och ett yttre skikt, som båda består av ben som bildas genom intramembranös förbening . Chordacentrum hos teleosterna bildas först genom utsöndring av benmatrisproteiner (t.ex. SPARC, typ I-kollagen) från ”chordoblast”-celler som befinner sig i notochordepitelet . Hos zebrafiskar har in vitro-försök visat att odlade notochordceller har förmågan att utsöndra benmatris, och ablationsexperiment har visat att om notochord saknas bildas inte chordacentra . Teleost chordacentra omges därefter av ett relativt sent utvecklat lager av membranben som härrör från paraxial mesoderm . Dessutom har zebrafiskmutanter med somitmönsterdefekter normalt utvecklade chordacentra, men uppvisar djupgående neural- och hemalbågsdefekter, vilket tyder på att bågvävnaderna troligen har ett paraxialt mesodermalt ursprung .

För att avgöra om det dubbla ursprunget av kotcentra är ett teleostspecifikt kännetecken för kotskelettet, eller ett generellt kännetecken för gnathostomer som har gått förlorat hos tetrapoder, behövs uppgifter om det embryonala ursprunget av kotorna från en outgroup till de beniga fiskarna (dvs. Osteichthyes: den grupp som omfattar tetrapoder och teleoster). Brottfästande fiskar (Chondrichthyes: hajar, rockor, rockor och holocefaler) intar en viktig fylogenetisk position som systergrupp till benfiskarna, och data från denna släktlinje kan därför användas för att dra slutsatser om de primitiva utvecklingsförhållandena för gnathostomernas sista gemensamma förfader. Vi har tidigare visat att ryggkotorna hos den lilla rocka (Leucoraja erinacea) var och en består av en dorsal neural ryggrad, två uppsättningar dorsala brosk som omsluter ryggmärgen (neuralbågar och interkalära bågar), en enda hemalbåge och ryggrad som sträcker sig ventralt, och ett treskiktigt centrum (figur 1) . Här använder vi oss av somit- och notochordsköpsskickskartläggningsexperiment samt mRNA-in-situ-hybridisering för gener som kodar för skelettmatrisproteiner, för att testa det embryonala ursprunget för ryggradsskelettet hos rocka. Vi visar att alla komponenter i skata kotskelett härstammar från paraxial mesoderm, utan att det finns några bevis för cellulära eller matrismässiga bidrag från notochordet. När de betraktas tillsammans med data från beniga fiskar pekar våra resultat på ett generellt och troligen primitivt paraxialt mesodermalt ursprung för kotpelaren hos ryggradsdjur med käkar.

Material och metoder

(a) Kartläggning av somiternas öde

Embryon från Leucoraja erinacea erhölls från Marine Biological Laboratory (MBL) i Woods Hole, MA, och förvarades i ett flödesbord i havet vid cirka 16 °C fram till S24. En flik skars av i ägghuset med hjälp av ett rakblad, och embryot och äggulan överfördes till en petriskål. Embryona sövdes i en lösning av MS-222 (100 mg l-1 etyl 3-aminobenzoat metansulfonat-Sigma-Aldrich) i havsvatten. CellTracker CM-DiI (Thermofisher) (5 µg µl-1 i etanol) späddes 1 : 10 i 0,3 M sackaros och injicerades i de ventrala delarna av somiterna (en till tre injektioner per embryo) med hjälp av en dragna glaskapillärkanyl och en Picospritzer tryckinjektor (figur 2a). Embryona sattes sedan tillbaka i sina ägglådor och återvände till havsbordet för att utvecklas i ungefär 7 eller 12 veckor. Embryonerna fixerades sedan med 4 % PFA enligt beskrivningen i Criswell et al. .

(b) Kartläggning av notokordets öde

Embryon hölls som beskrivet ovan fram till S14, då ett litet fönster skars ut i äggskalet över embryot. CM-DiI mikroinjicerades i notokordtriangeln enligt beskrivningen ovan (figur 2b). Fönstret förseglades sedan med donatorns äggskal och Krazy Glue™-gel (figur 2c), och äggen återfördes till havsbordet för att utvecklas i ytterligare 16-18 veckor före fixering (enligt beskrivningen i Criswell et al. ).

(c) Validering av CM-DiI-injektionens placering

För att verifiera CM-DiI-injektionernas korrekta placering fixerades tre somit-injicerade embryon omedelbart efter injektionen och tre notochord-injicerade embryon fixerades 5 dagar efter injektionen (dpi). Embryona fixerades i 4 % paraformaldehyd i PBS över natten vid 4 °C, sköljdes 3 × 15 minuter i PBS och färgades med DAPI i 1 µg ml-1 över natten vid rumstemperatur. Somit-injicerade embryon avbildades i ett Zeiss lightsheet-mikroskop och icke-kokord-injicerade embryon avbildades i Zeiss lightsheet- eller LSM 780-konfokalmikroskop.

(d) Histologi och mRNA-in-situ-hybridisering

CM-DiI-märkta L. erinaceaembryon bäddades in i paraffinvax och sektionerades med en tjocklek på 8 µm enligt beskrivningen i O’Neill et al. för histologisk analys. Före inbäddningen demineraliserades embryona i 10 % EDTA (etylendiamintetraättiksyra) i 14 dagar. Histokemisk färgning utfördes enligt Massons trichromprotokoll av Witten och Hall . In situ-hybridiseringsexperiment för Col1a1 (GenBank accession number MG017616) och SPARC (GenBank accession number MG017615) utfördes på sektioner enligt beskrivningen i O’Neill et al. , med ändringar enligt Gillis et al. .

Resultat

(a) Somitiskt bidrag till alla komponenter i rottingens kotskelett

För att testa somitiskt bidrag till rottingens kotskelett mikroinjicerade vi CM-DiI i ventrala delar av somiterna (dvs. det förmodade sklerotomet – figur 3a) hos rottingembryon i stadium (S) 24 (Ballard et al. ). Fokal märkning av somiterna (utan kontaminering av notochordal) bekräftades med ljusplattmikroskopi i embryon som fixerades omedelbart efter injektionen (figur 3b; n = 3). Vid 50-52 dpi (S31) omger de spindelformade cellerna i den areolära vävnad som utvecklas i centrum notochordet, och mesenchym i preskelettet har kondenserats runt neuralröret och den kaudala artären och venen. I alla embryon som analyserades i detta skede (n = 5) återfanns CM-DiI i de spindelformade cellerna i den areolära vävnaden som håller på att utvecklas (figur 3c), vilket tyder på att de har somitiskt ursprung.

För 109 dpi (S34) är kotorna fullt utvecklade, med neural-, interkalära och hemalbågar och ett centrum i tre lager (figur 1). I embryon som analyserades i detta skede (n = 4) återfanns CM-DiI-positiva celler i hela kotskelettet. CM-DiI-positiva celler återfanns i brosket i neural- (n = 3 kotor hos tre embryon) och hemalbågen (n = 6 kotor hos fyra embryon; figur 3d,e) samt i det inre brosklagret (figur 3f); n = 2 kotor i två embryon), den mellersta areolära vävnaden (figur 3g; n = 3 kotor i tre embryon) och det yttre brosket i centrum (figur 3h; n = 3 kotor i tre embryon). Sammantaget visar dessa fynd på somitiskt bidrag till alla viktiga komponenter i skata kotskelett.

(b) Inga bevis för notokordiskt bidrag till kotskelettet hos skata

För att testa om notokordet bidrar cellulärt till skata kotskelett utförde vi en serie experiment med fate-mapping av notokordet. Hos broskfiskar härstammar notochordet från ett litet triangulärt område med progenitorceller (notochordtriangeln) som uppträder vid den bakre kanten av blastodisken vid S12 . Vi märkte notokordtriangeln i rockaembryon med CM-DiI vid S14 (figur 4a), och vi bekräftade färgämnets lokalisering till notokordet vid 5 dpi (ca S17) med hjälp av konfokalmikroskopi. Hos tre embryon som undersöktes vid S17 hittades CM-DiI antingen endast i notokordet (n = 2) eller i notokordet och nervvävnad (n = 1) (figur 4b). I inget fall upptäcktes CM-DiI-märkta celler i den paraxiala mesodermen.

Vi märkte därför notochordtrianglarna på flera rockaembryon vid S14 och uppfödde dessa embryon till 116-129 dpi (S34 – då har kotskelettet differentierats fullständigt). CM-DiI återfanns i notokorden (figur 4c,c′) och notokordepitelet (figur 4d,d′) i de intervertebrala regionerna i axialpelaren (n = 5). Hos tre embryon återfanns CM-DiI-positiva celler i de rester av notochordepitel som finns kvar i centrum av centrum, där notochorden nästan helt har ersatts av centrumbrosk i det inre skiktet, men inga CM-DiI-positiva kondrocyter återfanns i själva det inre skiktet av brosk. Inga CM-DiI-märkta kondrocyter observerades i någon annan del av axialpelaren. Dessa experiment ger därför inga bevis för ett cellulärt bidrag från notochordet till det vertebrala skelettet.

I teleoster utsöndrar chordoblastceller i notochordepitelet matriskomponenter som utgör det acellulära benet i chordacentrum. Även om rockor inte har något chordacentrum mineraliseras den areolära vävnaden i rockans centrum, och den ligger vid sitt ursprung i anslutning till notochordepitelet . För att testa om notochordepitelceller bidrar med matriskomponenter till centrumvävnaden hos rocka har vi karakteriserat uttrycket av gener som kodar för benmatrisproteinerna Col1a1 och SPARC i utvecklande rockacentra. Vi upptäckte ingen transkription av Col1a1 (figur 5a) eller SPARC (figur 5b) i notochordepitelet. Dessa transkriptioner lokaliserades snarare till de spindelformade cellerna i den areolära vävnaden (figur 5a,b). Dessa fynd tyder på att de paraxiala mesodermavledda cellerna i själva areolvävnaden – och inte notochordepitelet – är källan till den extracellulära matrisen i den mineraliserade vävnaden i rottingens vertebrala centrum.

Diskussion

Våra experiment för att kartlägga somiternas öde visar att den presumtiva sclerotomen bidrar till alla komponenter i kotorna hos rocka, inklusive neural- och hemalbågarna och alla vävnader i det treskiktade vertebrala centrumet. Det är möjligt att DiI kan spridas genom den extracellulära matrisen efter injektion och kontaminera vävnader som ligger i anslutning till det avsedda målet (t.ex. notochord), men vi har kontrollerat denna möjlighet genom att avbilda en delmängd embryon kort efter injektion för att validera precisionen i vår märkning och genom att utföra kompletterande experiment för kartläggning av notochords öde. I det senare fallet fann vi att CM-DiI-märkning av notochordförstadieceller uteslutande resulterade i märkning av notochorden och notochordepitelet, utan något bidrag till kotvävnaden. Hos teleostfiskar uttrycker chordoblastceller i notochordepitelet gener som kodar för benmatrisproteinerna typ I-kollagen och SPARC och är troligen källan till benmatris för det tidigaste skiktet av ryggkotans centrum . Eftersom rockadjur också har ett mineraliserat skikt i sina vertebrala centra, försökte vi testa uttryck av Col1a1 och SPARC under rockadjurens vertebrala utveckling genom mRNA-in-situ-hybridisering. Vi fann att dessa gener uttrycktes uteslutande inom de somitiskt härledda spindelformade cellerna i areolvävnaden (föregångaren till det mineraliserade mellanskiktet i centrumet-Criswell et al. ), och inte i notochordepitelet. Dessa fynd tyder på att cellerna och matriskomponenterna i rottingens vertebrala centrum helt och hållet har ett paraxialt mesodermalt ursprung.

När vi betraktar dem tillsammans med data från beniga fiskar tyder vårt påvisande av ett somitiskt ursprung för rottingens vertebrala skelett på att denna vävnad troligen var den enda primitiva källan till vertebrala skelettvävnader hos gnathostomerna, och att ett bidrag från notokordet till centrumbenet representerar ett härledd tillstånd hos telekostfiskar (figur 6). Bevis från tidiga fossila fiskar med och utan käkar tyder starkt på att ryggradsskelettet hos gnathostomernas sista gemensamma förfader helt enkelt bestod av en serie neuralbågar och ett ihållande notochord, utan centra . Flera gnathostome-linjer, inklusive elasmobranchiska broskfiskar, teleoster och tetrapoder, utvecklade senare centra oberoende av varandra . Vid sitt ursprung härstammade de vertebrala centra hos elasmobrancher och tetrapoder helt och hållet från paraxial mesoderm , men ett inre skikt av acellulärt ben som härstammar från notochordet införlivades i centrat i samband med det oberoende ursprunget av teleosternas centra.

Det är dock ännu inte klart om detta specialiserade tillstånd hos teleosterna är unikt bland strålfeniga fiskar. Trots de senaste förändringarna i de fylogenetiska mönstren , har vertebrala centra med stor sannolikhet utvecklats oberoende av varandra i flera icke-teleost strålfeniga fisklinjer (t.ex. hos gars och bichirs ). Det är dock oklart om notochordet bidrar med vävnad till de olika formerna av centra som observerats hos dessa taxa. Omfattande analyser av det embryonala ursprunget av kotvävnader i strategiskt utvalda fisktaxa behövs för att bättre kunna lösa den evolutionära och utvecklingsmässiga sammansättningen av det varierande utbudet av axialskelett, som utan tvekan är det viktigaste kännetecknet, hos ryggradsdjur i allmänhet.

Etik

Alla experimentella arbeten utfördes i enlighet med de protokoll som godkändes av djurskydds- och djuranvändningskommittén vid MBL.

Datatillgänglighet

Sekvensdata för generna i denna studie finns tillgängliga på GenBank (Col1a1 accession nummer MG017616 och SPARC accession nummer MG017615).

Författarnas bidrag

K.E.C. utformade studien, utförde histologi, ödeskartläggning och in situ-hybridiseringsexperiment och utarbetade manuskriptet; M.I.C. samordnade studien och bidrog till manuskriptet; J.A.G. utformade delar av studien, samordnade studien och hjälpte till att skriva manuskriptet. Alla författare gav slutligt godkännande för publicering.

Kompletterande intressen

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Finansiering

Denna studie stöddes av en DDIG (DEB 1501749) från National Science Foundation, ett forskningspris för doktorander från University of Chicago/Marine Biological Laboratory, en resestipendium från Company of Biologists och ett internationellt stipendium från Royal Society-Shooter International (NF160762) till K.E.C.; Royal Society University Research Fellowship (UF130182), Isaac Newton Trust Grant (14.23z) och Marine Biological Laboratory Plum Foundation John E. Dowling och Laura and Arthur Colwin Research Fellowships till J.A.G.; och ett bidrag från National Science Foundation (DEB 1541491) och forskningsmedel från University of Chicago till M.I.C.

Footnotes

.