Den nya precisionsmedicinen kännetecknas av många nya förbättringar av diagnostiska, prognostiska och terapeutiska metoder och behandlingar. Som en del av detta initiativ har det funnits ett fokus på att minimera mängden vävnad som behövs för testning via mindre invasiva och säkrare förfaranden. En metod som har väckt stort intresse de senaste åren är ”flytande biopsi”. Även om definitionerna varierar när det gäller den exakta innebörden av detta begrepp kan det i stort sett betraktas som insamling av ett prov från en kroppsvätska för att testa relevanta biomarkörer i syfte att informera om patientens behandling. Det används oftast för insamling av perifert blod för analys av cellfria cirkulerande tumördeoxiribonukleinsyror (DNA).
Den första beskrivningen av cirkulerande cellfritt DNA i människoblod gjordes 1948, men detta väckte föga uppmärksamhet i det breda forskarsamhället. 2. Det finns en stor mängd olika typer av DNA i blodet. År 1977 identifierade forskare förekomsten av onormalt höga nivåer av cellfritt DNA (cfDNA) i plasma och serum från cancerpatienter i förhållande till friska kontrollpatienter, och detta cfDNA antogs huvudsakligen representera cirkulerande tumör-DNA (ctDNA)1,5. Sedan den ursprungliga beskrivningen har annan forskning visat att ökat cfDNA i allmänhet återspeglar en mängd patologiska processer, inklusive maligna och godartade neoplastiska tillstånd, inflammatoriska sjukdomar, stroke, trauma och sepsis. Under dessa processer kan nukleinsyror avges till blodet av apoptotiska och nekrotiska celler eller genom kontrollerad utsöndring av levande celler2,11. Medan cellfritt DNA ofta används synonymt med cirkulerande tumör-DNA bör man komma ihåg att cirkulerande icke-tumör-DNA och icke-mänskligt DNA också kan finnas i ett prov.
Men även om det nuvarande fokuset domineras av DNA omfattar ytterligare komponenter i en vätskebiopsi ribonukleinsyror (RNA), cirkulerande tumörceller (CTC), extracellulära vesiklar (EV) och tumörutbildade trombocyter (TEP). De sistnämnda komponenterna är främst av forskningsintresse. I takt med att mer translationell forskning utförs kan dessa ytterligare komponenter i en flytande biopsi få ökad klinisk användning i framtiden. En genomgång av dessa komponenter ligger utanför ramen för denna artikel och läsaren hänvisas till artikeln av Batth et al för vidare läsning.
Tekniska överväganden
Intill nyligen har den tillgängliga tekniken inte varit tillräckligt känslig för att detektera ctDNA och använda det på ett meningsfullt sätt. Till skillnad från molekylära analyser som utförs på kroppsvätskor för detektion av nukleinsyror från virus och andra mikroorganismer, som drar nytta av relativt stora mängder nukleinsyror, förekommer cirkulerande tumörnukleinsyrefragment i en bråkdel av det normala cfDNA som inte är tumör. ctDNA är vanligen små DNA-fragment i storleksordningen 140-170 baspar (bp)3 , och tumörtyp, progression, belastning, spridningshastighet och terapi påverkar alla mängden ctDNA i ett prov. Även om ctDNA är relativt stabilt i plasma och serum avlägsnas det dessutom från cirkulationen av lever och njurar inom några timmar 3,4. Trots detta har framsteg inom föranalytiska processer och reningsmetoder gjort det möjligt att framgångsrikt fånga, förstärka och sekvensera ctDNA.
Metoder som för närvarande används för att detektera eller mäta ctDNA kan i stort sett delas in i två kategorier: polymerasekedjereaktionsbaserade (PCR) och nästa generations sekvenseringsbaserade (NGS). PCR-baserade tester har i allmänhet en snabbare genomströmningstid och är billigare, men kan vanligtvis bara bedöma en eller ett fåtal specifika mutationer åt gången (begränsad multiplexeringsförmåga). PCR-baserade metoder kan ytterligare delas in i metoder som anrikar mutantsekvenser i förhållande till vildtyp (icke-mutant) och metoder som uppnår kvantifiering genom kompartmentalisering. Ett exempel på den senare gruppen är ”digital PCR” som börjar användas i stor utsträckning för att upptäcka och kvantifiera specifika, kända mutationer i ctDNA. PCR:n delas in i tusentals små individuella reaktionsvolymer, antingen på ett chip eller genom att skapa vatten-i-oljedroppar. Varje del eller droppe innehåller antingen ett målinriktat mallfragment eller inte och producerar en fluorescerande signal om ett lämpligt mallfragment finns i den volymen. Genom att räkna de enskilda fluorescerande volymerna är det möjligt att uppskatta antalet specifikt riktade mallmolekyler i provet. För flera mål som testas samtidigt (multiplexering) kan olika fluorescerande signaler tilldelas specifika variantsekvenser.
Nästa generationens sekvenseringsbaserade metoder gör det möjligt att bedöma ett mycket bredare spektrum av möjliga mutationer eftersom sekvensering kan upptäcka mutationer som uppstår var som helst inom de fångade regionerna. För att rikta in sig på mutationsbenägna regioner av genomet kan NGS-bibliotek framställas från plasma-DNA med hjälp av antingen ligations/hybridfångstmetoder eller riktade PCR-anrikningsmetoder. Variantallelfraktionen är i allmänhet mycket lägre i vätskebiopsier än i vävnadsbiopsier, ofta <1 %, så regioner av intresse måste sekvenseras djupare än vid NGS av primär tumörvävnad. Dessutom måste omfattande optimering av preanalytiska och analytiska processer göras för att maximera det ingående provet och minska PCR- och sekvenseringsfel. NGS-metoder har den viktiga fördelen att de kan uppnå en mycket bredare mutationstäckning (samtidig analys av tusentals möjliga mutationer). Därför behövs ingen förhandskunskap om tumörens specifika mutationer. Jämfört med enklare PCR-baserade metoder är dock NGS-tekniker dyrare, tidskrävande och mer tekniskt utmanande.
Fördelar och nackdelar
Fördelarna med vätskebiopsier ligger främst i att förfarandena för att få fram dem är mycket mindre invasiva än vanliga tumörbiopsier. Tänk till exempel på den process som krävs för att ta en biopsi av en lungmassa. Om massan ligger på en plats som är tillgänglig genom interventionell radiologi eller kirurgisk biopsi finns det en risk för pneumothorax eller blödning, trots kostnaderna för att upprätthålla en operationssal där operationen kan utföras. Flytande biopsier möjliggör också mer frekventa och seriella provtagningar över tiden för att ge en bättre upplösning av tumörernas beteende och deras svar på behandling. I en studie visade till exempel kolorektalcancerpatienter som senare radiografiskt visade ett bra svar på behandlingen att ctDNA-nivåerna hade sjunkit med >90 % efter de första två veckorna av behandlingen 9. Detta har visat sig stratifiera risken för återfall efter resektion med kurativt syfte. I en annan studie hade bröstcancerpatienter med detekterbart ctDNA efter resektion en 25 gånger högre risk för återfall 10. Dessa koncept är analoga med de tester som för närvarande görs för hematologiska maligniteter, t.ex. kronisk myeloisk leukemi (CML) och serietestning för förekomst av BCR-ABL-fusionstranskript. Slutligen, i de fall då en vävnadsbiopsi inte är tillgänglig kan molekylär profilering av tumörer fortfarande utföras via vätskebiopsi.
Viktiga nackdelar med vätskebiopsi är bl.a. att en första histologisk diagnos måste erhållas genom vävnadsbiopsi. Laboratorier som utför dessa tester måste vara uppmärksamma på lämplig testanvändning och risken för ”övertolkning” i kliniska sammanhang. Den låga variantfrekvensen inom det perifera blodet kan leda till högre falskt negativa tal och kräva betydligt större tekniska insatser och expertis för att få tillförlitliga resultat.
Aktuella och nya tillämpningar
Den kliniska användningen av vätskebiopsi har ökat avsevärt sedan 2014, då den första kommersiellt tillgängliga plattformen för vätskebiopsi med flera gener blev tillgänglig. Flera analyser är kommersiellt tillgängliga och FDA-godkända, och vissa anses vara tillräckliga för behandlingsberättigande av försäkringsbolag. Till exempel godkände FDA 2016 cobas® EGFR Mutation Test v2 för att avgöra om patienter med icke-småcellig lungcancer är berättigade att få vissa EGFR tyrosinkinashämmare . Införandet av flytande biopsi för att utesluta patienter från riktad behandling har haft ett mycket långsammare kliniskt införande, främst på grund av oro för falskt negativa resultat och allmänt tillgänglig tumörvävnad 3 . Det ökande kliniska utnyttjandet har också drivits av patienter och läkare som vill identifiera målinriktade mutationer för off-label-användning eller registrering i kliniska prövningar.
Nya användningsområden för vätskebiopsier är bland annat att de används som ett komplement till mutationsprofilering av vävnadsbiopsier, för att bedöma behandlingssvar, övervakning av restsjukdom, upptäckt av återinsjuknande i sjukdomen samt för att övervaka uppkomsten av resistensmutationer 3 .
Framtida riktningar
Den förväntade cancerspecificiteten hos mutationer gör ctDNA till en attraktiv biomarkör för tidig upptäckt av cancer, vilket skulle kunna ha en enorm inverkan på patientvården. Eftersom tumörer i tidiga stadier är kända för att avge mycket lite DNA finns det dock många tekniska utmaningar som måste övervinnas. Även om flytande biopsi kan vara ett attraktivt verktyg för cancerscreening hos asymtomatiska patienter måste sådana tillämpningar övervägas noggrant och genomtänkt för att undvika överdrivet patientlidande och kostnader på grund av falskt positiva resultat. På kort sikt kan flytande biopsier vara till större hjälp för att bekräfta malignitet hos patienter med redan kliniskt eller radiografiskt uppenbara lesioner.
Slutsats
Litteraturen med fokus på ctDNA-testning expanderar och utvecklas snabbt. Pågående undersökningsområden omfattar preanalytiska processer, faktorer som påverkar ctDNA-detektionsgraden och prospektiva kliniska prövningar. Det är troligt att vi kommer att se en mer utbredd roll för ctDNA i den kliniska vården, eftersom fortsatt forskning om CTCs, cfDNA/RNA och extracellulära vesiklar kommer att ge ökad upplösning till den ögonblicksbild av tumörstatus som erhålls genom flytande biopsier 4.
.