Chaetomium-liknande svampar som orsakar opportunistiska infektioner hos människor: en möjlig roll för extremtolerans

Identifiering av filamentösa mögelsvampar i det kliniska rutinlaboratoriet baseras fortfarande huvudsakligen på mikroskopisk undersökning av sporulerande kolonier. Svampar som saknar sporocarps eller karakteristiska sporer är svåra att identifiera (Pounder et al. 2007; Santos et al. 2013). I denna studie analyserades 13 sterila eller odiagnostiska stammar. Baserat på fenotypiska egenskaper identifierades isolaten som Papulaspora-arter på grund av bildandet av klumpar eller bulbil-liknande strukturer (Vinod Mootha et al. 2012). Med försök att inducera sporulering med hjälp av olika substrat och inkubationsförhållanden producerade vissa stammar små konidier på korta fialider, men ändå var dessa konidier inte diagnostiskt användbara och kunde inte användas för artbestämning.

Med molekylär och fylogenetisk analys av sex loci visade sig stammarna tillhöra tre nya arter som beskrivs i den här studien. Två arter klustrade med typarten av släktet Subramaniula, medan en var syster till två beskrivna Chaetomium-arter. Både Subramaniula och Chaetomium tillhör familjen Chaetomiaceae (Sordariales). Medlemmarna i denna familj kännetecknas av att de bildar ascosporer i deliquescent asci inuti mer eller mindre omfattande ornamenterade perithecier (Whiteside 1961). Fenotypisk identifiering av arter i Chaetomiaceae beror främst på formen på ascomatalhåren, ascoma-pigmentering och ornamentering samt ascosporernas form (Ames 1961; von Arx et al. 1984). De tre beskrivna arterna i den aktuella studien uppvisade ovanliga morfologiska kännetecken genom att de inte kunde bilda sexuell reproduktion i ascomata. Istället förekom kluster av tjockväggiga, mörkt pigmenterade celler. Det är oklart om dessa strukturer representerade omogna perithecier (Davey et al. 2008). Inom ramen för den singulära nomenklaturen för svampar (Taylor 2011) beskrivs arterna här ändå i sexuella släkten på grundval av deras fylogenetiska position inom Chaetomiaceae.

De två nya arterna som klubbas med Subramaniula härstammar från kliniska källor, oftast ögon- eller hudinfektioner. Det koprofila släktet Subramaniula är för närvarande känt från två arter som överfördes från Achaetomium, nämligen S. irregularis och den generiska typarten S. thielavioides (Cannon 1986; von Arx 1985; von Arx et al. 1978). Släktet Subramaniula kännetecknas av kala bleka askomata med breda apikala öppningar (Fig. 8), utan känd asexuell morf. Cannon (1986) rapporterade ”Ett fåtal hyfer med kedjor av avsevärt svullna celler, som producerar tunnväggiga klotformiga eller ellipsoida kroppar med en diameter på upp till 8 μm, men kan mycket väl inte fungera som förökningsorgan”. Vissa författare föreslog att dessa kroppar kan vara relaterade till svampens asexuella tillstånd (Pastirčák och Pastirčáková 2009). Vid undersökningen av ex-typstammen av S. thielavioides (CBS 122.78) upptäckte vi kedjor av svullna celler, men inga tunnväggiga kroppar sågs. Jämfört med våra två nya Subramaniula-arter där konidier observerades är det osannolikt att dessa strukturer är konidier, utan de kan fungera som överlevnadspropagulationer. Subramaniula irregularis (syn. Achaetomiella irregulare) beskrivs som morfologiskt lik S. thielavioides med vissa skillnader i form och storlek på ascosporer och pigmentering av askomata, men ingen levande kultur finns tillgänglig för denna art (Cannon 1986).

Subramaniula thielavioides har isolerats från ett gödselprov från Indien, medan S. irregularis endast är känd från jord i Sydafrika (Cannon 1986; von Arx et al. 1978). Hittills har ingen infektion hos människor kunnat tillskrivas Subramaniula. Cannon (1986) rapporterade dock isoleringen av S. thielavioides från en mänsklig nagel och intressant nog rapporterade han att ”medicinska mykologer bör vara medvetna om dess existens”. Med de två nyligen beskrivna kliniska arterna bekräftas att släktet Subramaniula har potential att vara ett opportunistiskt släkte som eventuellt orsakar hud-, ögon- och nagelinfektioner. En oidentifierad stam från ett hornhinnesår som publicerades av Vinod Mootha et al. (2012), CBS 123294, beskrivs i denna studie som en ny art Subramaniula asteroides. Stammen återfanns från en patient som bar en kontaktlins och som skadades med en vajer när han arbetade i ett häststall. Stam dH 21571 gällde en keratit som uppstod efter ögontrauma med ett vasst växtblad på ett jordbruksfält i tropiska Indien. Ytterligare två stammar från USA härstammade också från sår på hornhinnan. Ytterligare två stammar från ögoninfektioner i Spanien överensstämde med S. asteroides; CNM-CM 4314 isolerades från hornhinneexudat hos en 27-årig manlig patient, CNM-CM 7482 härstammade från en endoftalmit hos en 47-årig immunsupprimerad patient; hyfer observerades i glaskroppen och patienten förlorade ögat. Subramaniula asteroides verkar alltså ha ett starkt samband med traumatiska ögoninfektioner. Under denna studie identifierades också en annan sekvens från ett isolat (UTHSC 03-1315) från hud från en patient från Saudiarabien som också identifierades som S. asteroides. Det enda miljöisolat av S. asteroides kom också från Saudiarabien, nämligen från sandig ökenjord under kolvätepåverkan. Det återfanns genom toluenanrikning (Zhao et al. 2010), en metod som är utformad för isolering av svampar som växer under toxiska förhållanden.

Subramaniula obscura beskrivs i denna artikel för en enda stam från en 53-årig man från Kuwait som hade en tåinfektion. Stammen identifierades ursprungligen som Chaetomium cuniculorum. Vi fann att stammar av C. cuniculorum är fylogenetiskt besläktade med S. obscura, eftersom båda återfanns i en enda, understödd klad, baserad på både ribosomal genanalys (ML-BS/PP, 84 %/1,0) och multilocusanalys av proteinkodande gener (ML-BS/PP, 100 %/0,99) (fig. 2). Med ITS-sekvensering och med hjälp av ett begränsat antal taxa kan det faktiskt vara svårt att skilja de två arterna åt. ITS-sekvensen hos ex-typstammen av S. obscura, CBS 132916, visade 97 % likhet med isolat av C. cuniculorum. Den sistnämnda arten tros förekomma främst på gödsel och ungefär hälften av de C. cuniculorum-stammar som bevaras i CBS:s kultursamling har sitt ursprung i gödsel från växtätande djur. ITS-likheten mellan S. obscura och S. thielavioides är 99,4 %, men de proteinkodande generna är konsekvent olika och därför är det motiverat att beskriva den nya arten i Subramaniula.

Makro- och mikromorfologin hos Subramaniula obscura liknar den hos S. asteroides, med undantag för att cellerna som bildar klumparna hos S. obscura är brunare och rundade, och att hyferna är tjockare och med vårtartade utskjutningar. Den lägsta tillväxttemperaturen för båda arterna och för S. thielavioides är 6 °C, och de växte alla mycket bra över 40 °C, vilket tyder på att Subramaniula-arter är termotoleranta. Optimal tillväxt var mellan 33 och 36 °C, och konsekvent överlevnad vid 37 °C visar att förmågan att växa vid människokroppens temperatur är en virulensfaktor (Revankar och Sutton 2010).

Identifiering av Chaetomium anamorphosum-stam CBS 137114 som en ny art, som återfanns från mänsklig peritonit, skedde inledningsvis genom morfologisk jämförelse med beskrivna Papulaspora-arter. Denna stam visade viss likhet med Papulaspora nishigaharanas genom bildning av aggregat av brunfärgade, tjockväggiga celler samt genom produktion av phialoconidier (Watanabe 1991). Jämförelse av sekvenser av ITS och D1/D2-regionen av 28S rRNA-genen i GenBank avslöjade ingen homologi med någon känd sekvenserad art. Med den molekylära fylogenetiska metoden kunde vi lösa taxonomin för detta isolat som en nära släkting till de ascosporulerande arterna Chaetomium irregulare och C. fusisporum (fig. 1, 2 och 9). Den nyidentifierade arten skilde sig från C. irregulare och C. fusisporum, inte bara i morfologi utan även i tillväxttemperaturen. Den optimala tillväxttemperaturen för C. anamorphosum var 33-36 °C och tillväxt observerades fortfarande vid 40 °C, medan den optimala tillväxttemperaturen för C. irregulare var 30 °C och den kunde inte växa eller växte endast dåligt vid 40 °C. Chaetomium irregulare överfördes till släktet Achaetomium av Rodríguez et al. (2004). Vid en jämförelse med den generiska typen Achaetomium globosum visade det sig dock att den är avlägsen och namnet Achaetomium irregulare är överflödigt. Taxonomin och nomenklaturen för kladen som innehåller den nya arten och andra Chaetomium spp. som parafyletiska till Subramaniula är oklar på grund av det relativt stora avståndet till den generiska typarten C. globosum. Dessutom skiljer sig morfologin hos askomata, askomatala hår, om sådana finns, och ascosporer hos arterna i denna klad från den hos C. globosum. Släktena Chaetomium, Achaetomium, Subramaniula och Achaetomiella var morfologiskt likartade med endast några få skillnader i närvaron eller frånvaron av askomatala hår, askomaväggen, ascosporernas färg och i tillväxthastighet (Cannon 1986). Dessa karaktärer har i stort sett blivit irrelevanta på grund av tillgången till molekylära data. I väntan på en taxonomisk revision av Chaetomium bibehåller vi den nuvarande klassificeringen av klustret inom detta släkte och erkänner Subramaniula som ett släkte inbäddat i Chaetomium.

Trots det stora antalet beskrivna arter inom Chaetomium och släktingar vet man lite om deras molekylära taxonomi och endast ett fåtal arter har sekvenserats och finns tillgängliga i offentliga databaser (Wang et al. 2014). De flesta av de tidigare studierna var begränsade till sällsynta arter, och fylogenin för mer allestädes närvarande Chaetomium-arter är fortfarande olöst (Asgari och Zare 2011; Lee och Hanlin 1999; Wang et al. 2014). Nyligen beskrevs tre nya arter i C. indicum-gruppen baserat på molekylär analys av fyra gener (Wang et al. 2014). En annan molekylär studie av Chaetomium var den som Asgari och Zare (2011) genomförde i Iran med hjälp av fylogenetisk analys av tre gener, vilket resulterade i avgränsningen av sex nya arter. Två av dessa uppvisade asexuella morfer som liknar dem som bildas av Chaetomium anamorphosum och av de båda Subramaniula-arter som beskrivs i denna artikel. Chaetomium rectangulare Asgari och Zare (2011) tillhör C. globosum-gruppen som kännetecknas av asexuella morfer med phialider och konidier som är mycket lika dem hos vår nya art. Detta kan tyda på att de nya arterna på något sätt förlorat sin förmåga att bilda sexuell fruktbildning och ersatt denna med en asexuell typ av sporulering. Sekvensering av MAT-lokuset som reglerar den sexuella reproduktionen skulle kunna indikera om de sexuella morferna hos dessa arter är frånvarande eller undertryckta.

Djurgödsel, ruttnande vegetabiliskt material och jord är kända naturliga livsmiljöer för Chaetomium-, Subramaniula- och Papulaspora-arter. De Hoog et al. (2013b) noterade att släktet Madurella är inbäddat i Chaetomium och att många arter i Chaetomiaceae kombinerar dyngassociation med torra klimatförhållanden. Genom att lägga till de tidigare oidentifierade icke-ascosporulerande arterna till Chaetomium har detta släktes roll i sjukdomar hos människor och djur ökat avsevärt. Chaetomium-infektioner och infektioner av arter som grupperar sig i Chaetomiums fylogenetiska träd, såsom Chaetomidium och Thielavia, har rapporterats från hud, hår och naglar (Hubka et al. 2011; Kaliamurthy et al. 2011; Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). Dessutom har flera arter av Chaetomiaceae rapporterats orsaka allvarliga opportunistiska infektioner hos immunsupprimerade patienter (Al-Aidaroos et al. 2007; Guppy et al. 1998; Hoppin et al. 1983). Flera fall av peritonit liknande vår i C. anamorphosum har rapporterats hos immunsupprimerade individer som hade fått infektionen under peritonealdialys. Febré et al. (1999) isolerade C. globosum från flaskor med dialysvätska; peritonit rapporterades av Baer et al. (2013). Ett intressant fall som publicerades av Issa et al. (2013) gällde en peritonit hos en immunkompetent kvinna från Damam, Saudiarabien, orsakad av en okänd Chaetomium-art. Uppenbarligen löper även immunkompetenta individer risk att drabbas av djupa infektioner av Chaetomium eller besläktade svampar. Som exempel kan nämnas att ett fall av dödlig cerebral phaeohyphomycos orsakad av Thielavia subthermophila har rapporterats hos immunkompetenta individer (Badali et al. 2011). Chaetomium atrobrunneum, C. perlucidum och C. strumarium betraktades nu som neurotropa arter som orsakar allvarliga och livshotande infektioner (Abbott et al. 1995; Barron et al. 2003; Guppy et al. 1998). Det verkar som om medlemmar av Chaetomiaceae verkligen har en underskattad klinisk potential, och en omvärdering av släktets roll i mänsklig patologi är brådskande. Många arters naturliga livsmiljö i torra klimat och deras överlevnad vid höga temperaturer ökar förmodligen deras överlevnad i däggdjursvävnad. C. anamorphosums förmåga att växa optimalt vid 36 °C, till skillnad från C. irregulare, är ett bra exempel. Arterna kan bryta den termiska uteslutningszonen i människokroppen och om det finns immunosuppression eller andra immunologiska problem kan svampar dyka upp som potentiella humanpatogener (Casadevall 2012).

På grund av identifieringssvårigheter på grundval av fenotypiska kriterier kan vissa äldre fall av Chaetomium- eller Subramaniula-arter felaktigt ha bortsetts från eller rapporterats som fall av Madurella- eller Papulasporainfektion (Mohd-Tahir et al. 2012). Våra studier visar tydligt att traumatiska och opportunistiska infektioner av Chaetomium-liknande arter ofta ger upphov till icke eller dåligt sporulerande stammar i kultur (Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). Beskrivningen av dessa stammar som separata taxonomiska enheter i släktet är betydelsefull ur både klinisk och epidemiologisk synvinkel. Dessutom finns det få studier om svampmottagningsförmåga, och behandlingsprotokoll behövs snarast.

Lämna ett svar Avbryt svar