Participanți umani

Experimentele din Spania au fost revizuite și aprobate de Comitetul de Etică al Spitalului Universitar La Fe Valencia și au aderat la principiile Declarației de la Helsinki și la revizuirile ulterioare. Experimentele din Berlin au fost aprobate de comitetul de etică al Charité-Universitätsmedizin, Berlin (EA4/012/05). Au fost studiate două cohorte: una formată din 65 de voluntari adulți sănătoși și una formată din 16 pacienți cu sindrom Usher (tip II) purtători de diferite mutații de trunchiere în USH2A. Datele de la trei pacienți au fost omise din prezentul studiu din cauza faptului că doi pacienți aveau un diagnostic anterior de diabet și un pacient cu sindrom de tunel carpian, care ar putea afecta pragurile psihofizice. Participanții la studiu au fost testați cu o baterie formată din nouă teste psihofizice aplicate pe piele. Toți participanții au primit informații scrise și orale înainte de a lua parte la studiu și și-au dat consimțământul scris. Niciunul dintre participanții la studiu nu a avut vârsta <20 de ani. Următoarele informații despre participanți au fost documentate: vârsta, sexul, mâna, dispozitivele auditive (aparate auditive, implanturi cohleare), severitatea simptomelor de surditate și orbire și comorbidități.

Testarea senzorială cantitativă umană

Testarea psihofizică a fost efectuată în conformitate cu protocolul de testare standardizat al testării senzoriale cantitative al Rețelei germane de cercetare a durerii neuropatice44. Pragurile de percepție vibrotactilă la diferite frecvențe au fost determinate cu ajutorul unui test cu două alegeri1,2. Dispozitivul a fost compus dintr-un actuator piezo liniar (Physik Instrumente, nr. de catalog P-602.1 L), ale cărui deplasări sunt acționate și controlate de un amplificator/controler (Physik Instrumente, nr. de catalog E-665). Semnalele au fost procesate de sistemul de achiziție de date PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments). Stimulul de vibrație a avut o durată de 1,8 s, iar timpul de creștere și de scădere la început și la decalaj a fost de 500 și, respectiv, 600 ms, independent de frecvența sau amplitudinea testului. Durata stimulului între fazele de pornire și de decalare a fost de 700 ms. A fost utilizat un set de stimuli de vibrație care a fost scalat logaritmic între 18 nm și 45 μm. Pentru testele de vibrație de 10-Hz și 125-Hz, amplitudinea inițială a fost stabilită la 7,18 μm și, respectiv, 2,84 μm. Nu am măsurat în mod direct mișcarea sondei în condițiile de testare utilizate. Acest dispozitiv de acționare piezoelectrică prezintă o fidelitate ridicată, dar, teoretic, ar putea apărea o atenuare a amplitudinii cu deplasări de amplitudine mai mare în apropierea amplitudinii maxime de deplasare a dispozitivului de acționare (35 μm). Cu toate acestea, toți participanții au prezentat praguri psihofizice cu mult sub 35 µm pentru toate frecvențele testate (Fig. 1c). Rețineți că exact același aparat a fost utilizat pentru măsurători la martorii sănătoși și la participanții cu sindrom Usher. Stimulii de vibrație mecanică au fost administrați la nivelul pielii între patul unghiei și prima articulație a degetului mic. Sonda a fost fabricată din sticlă și avea o zonă de contact circulară, plată, cu diametrul de 5 mm, cu o contragreutate din alamă pentru a se asigura că același grad de forță de menținere a fost aplicat la fiecare participant. Degetul mic al mâinii dominante a fost testat pe două frecvențe (10 Hz și 125 Hz; durată de 1,8 s). Participanții au semnalat detectarea unui stimul vibrator în timpul uneia dintre cele două ferestre de timp prin apăsarea unui buton. Protocolul a constat într-un design de tip sus-jos care a crescut sau a scăzut amplitudinea stimulului (între 18 nm și 45 µm), în funcție de rata de succes în timpul sarcinii. Au fost efectuate opt inversări de amplitudine sus-jos (un total de ~40-80 de încercări individuale pe sesiune) în jurul pragului perceptiv pentru a crea un prag perceptiv mediu pentru fiecare pacient. Amplitudinea stimulilor de vibrație acționați de dispozitivul piezo a fost calibrată prin măsurarea amplitudinii de deplasare a sondei sub un microscop la creșteri de tensiune în trepte.

Un test de acuitate tactilă a fost, de asemenea, utilizat pentru a testa limitele rezoluției spațiale a vârfului degetelor (inervație mediană), folosind un test de orientare a grilei tactile cu alegere forțată, în două intervale, cu un cub de acuitate tactilă, care a constat din șase laturi cu grilaje de diferite lățimi (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 și 6,0 mm)1,2,3. Participanții au fost legați la ochi, iar cubul a fost plasat în orientare verticală sau orizontală pe vârful degetului lor. A fost utilizată o procedură cu două coborâri și o ridicare cu 10-15 puncte de cotitură a mărimii grătarelor. Pragurile (71% răspuns corect) au fost calculate ca mediana de la ultimele 10 din cele 15 puncte de întoarcere2. Pragurile de detecție mecanică au fost determinate folosind un set standardizat de 23 de filamente vFh (Optihair3-Set) cu forțe cuprinse între 0,25 și 265 mN. VFhs au fost aplicate într-o ordine ascendentă pe fața dorsală a mâinii (inervație radială) timp de 1 s până când participantul a perceput o senzație tactilă. Ordinea a fost apoi inversată până în momentul în care participantul nu a mai perceput o senzație tactilă. Forța medie a cinci inversări a fost considerată drept prag. Pragurile de durere mecanică au fost testate cu un set de șapte stimulatoare pinprick ponderate (MRC Systems) cu vârfuri de 0,25 mm și forțe cuprinse între 8 și 512 mN. A fost efectuată o metodă simplă de scări (regula unu în sus și unu în jos), în care pacienții au fost întrebați dacă stimulul a fost perceput ca fiind ascuțit care a provocat senzația de durere prin înțepare. Stimulii au fost aplicați pe fața dorsală a mâinii după sarcinile de detectare a vFh. Pragul a fost calculat din media a cinci inversări. Pragurile de percepție termică caldă și rece, precum și pragurile de durere caldă și rece, au fost testate cu ajutorul unui analizor termosenzorial TSA II (MEDOC). Termodul a avut o suprafață de 9 cm2, temperaturi de întrerupere între 0 și 50 °C și o rată de schimbare a temperaturii de 1 °C s-1. Termodul a fost plasat pe fața volară a regiunii anterioare a antebrațului (inervație antebrahială medială). S-au efectuat trei încercări consecutive pentru fiecare test termic în următoarea ordine: detectarea la rece, detectarea la cald și pragurile durerii la rece și durerii la cald. Participanții la studiu au fost rugați să indice în ce moment au început să resimtă răcirea, încălzirea, durerea la rece și la căldură. Pragurile au reprezentat temperatura medie a celor trei încercări din fiecare test.

Șoareci

Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul de etică pentru animale din Berlin (Landesamt für Gesundheit und Soziales) și au fost efectuate în conformitate cu legislația europeană privind bunăstarea animalelor. Au fost folosiți șoareci masculi și femele Ush2a-/-/- și colegi de rânduri de tip sălbatic (Ush2a+/+) din fondul CBA/CaJ cu vârste cuprinse între 10 și 30 de săptămâni11. Toate experimentele anatomice și electrofiziologice au fost efectuate pe un număr aproximativ egal de șoareci femele sau masculi. Pentru sarcina de detectare a vibrațiilor au fost utilizați numai șoareci femele. Toți șoarecii au fost menținuți într-un ciclu de 12 h lumină:12 h întuneric.

Anatomia țesutului de șoarece și imunohistochimie

Pentru imunohistochimia pielii, șoarecii au fost eutanasiați prin inhalare de CO2 timp de 2-4 min, urmată de dislocare cervicală, iar țesutul pielii labei piciorului a fost disecat, iar hipodermul, ligamentele și țesutul muscular atașat au fost îndepărtate. Probele de piele au fost întinse cu ajutorul unor ace de insectă și fixate timp de 45 de minute în paraformaldehidă 4% (PFA). Pentru secțiunile vibratomei cu gelatină, probele de țesut au fost plasate în matrițe de încorporare (Polysciences, T-8), umplute cu gelatină caldă (20%, dizolvată în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) 0,1 M) și post-fixate în PFA 4% peste noapte la 4 °C înainte de a se tăia secțiuni de 120 µm cu ajutorul unui vibratom (Leica, VT100S). Pentru colorarea întregului montaj, probele de piele au fost întinse timp de 2 h în PFA, apoi postfixate la 4 °C timp de 24 h în 20% dimetilsulfoxid și 80% metanol. După tăiere sau post-fixare, probele de țesut au fost spălate de trei ori în PBS (0,1 M) și incubate timp de 72 h la 4 °C în soluție de blocare și anticorpi primari. Probele au fost apoi spălate de trei ori în PBS înainte de incubarea timp de 24 h (4 °C) cu anticorpi secundari diluați în soluție de blocare. Țesuturile au fost spălate din nou de trei ori și au fost prelucrate pentru curățarea țesuturilor cu 2,2′-thiodietanol (TDE, Sigma-Aldrich). Secțiunile au fost plasate în concentrații din ce în ce mai mari de TDE la fiecare 2 h, de la 10% la 25%, 50% și 97%, în care probele au fost păstrate și montate pe lamele și acoperite.

Anticorpii policlonali care vizează Ush2A au fost generați la iepure de către Eurogentec. Au fost creați patru anticorpi care se leagă la diferiți epitopi de legare pe terminațiile N- și C-terminale ale Ush2A (terminația N-terminală: anticorpul 1, CSPLYNDKPFRSGDNV și anticorpul 2, C+SWEKPAENFTRGEII; terminația C-terminală: anticorpul 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR și anticorpul 2, CIRERPPLVPLQKRMT), și au fost purificați din antiseruri înainte de utilizare. Toți cei patru anticorpi au fost utilizați împreună (1:200) pentru protocoalele de colorare în colorări secvențiale cu anti-NF200 de pui (Millipore, 1:1.000), anti-S100 de iepure (Dako, 1:1.000) sau anti-CK20 de cobai (Origene Tech, 1:200). Anticorpii secundari utilizați au fost anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1:800), anti-copii Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800), anti-șoarece Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), anti-rabbit Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800) și anti-porcine de Guineea Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). Imaginile în z-stack au fost obținute cu ajutorul unui microscop confocal (Carl-Zeiss, nr. de catalog LSM700) folosind software-ul Zen2009. Corpusculii lui Meissner și foliculii de păr care inervează fibrele nervoase NF200+ și S100+ au fost vizualizați și numărați cu ajutorul Fiji/ImageJ. Pentru imaginile de microscopie electronică ale nervului sciatic, animalele au fost perfuzate, iar nervul sciatic a fost disecat și fixat în PFA 4% și glutaraldehidă 2,5% și contrastat cu tetroxid de osmiu înainte de a fi încorporat în rășină Technovit 7100 (Heraeus Kulzer). Secțiunile ultra-subțiri au fost capturate la o mărire de 5 600×. Fibrele nervoase mielinizate și fibrele nemielinizate au fost numărate și măsurate cu ajutorul software-ului Fiji/ImageJ.

Reproductibilitate

Toate experimentele imunohistochimice și imaginile capturate au fost repetate în mai multe cohorte de șoareci în zile diferite și nu au fost luate imagini de la indivizi singuri care nu au putut fi reproduse. Imaginile de microscopie electronică au fost prelevate de la diferite perechi de animale dintr-o singură serie de experimente.

Preparare a nervului cutanat de șoarece și înregistrări aferente senzoriale

S-au efectuat înregistrări ale fibrelor senzoriale cutanate folosind preparatul ex vivo al nervului cutanat. Șoarecii au fost eutanasiați prin inhalare de CO2 timp de 2-4 min, urmată de dislocare cervicală. Trei preparate diferite au fost realizate în experimente separate folosind diferite regiuni ale labei piciorului: nervul safenian care inervează pielea păroasă a labei posterioare21; nervul tibial care inervează pielea glabră a labei posterioare; și nervii medial și cubital care inervează pielea glabră a labei anterioare20. În toate preparatele, pielea păroasă a membrului a fost rasă, iar pielea și nervul au fost disecate și transferate în camera de înregistrare, unde țesuturile musculare, osoase și tendinoase au fost îndepărtate de piele pentru a îmbunătăți calitatea înregistrării. Camera de înregistrare a fost perfuzată cu un lichid interstițial sintetic la 32 °C: 123 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO4, 1,7 mM NaH2PO4, 2,0 mM CaCl2, 9,5 mM gluconat de sodiu, 5,5 mM glucoză, 7,5 mM zaharoză și 10 mM acid 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etanesulfonic (Hepes), pH 7,4. Pielea a fost fixată și întinsă, astfel încât partea exterioară a pielii să poată fi stimulată cu ajutorul sondelor stimulatoare. Nervul periferic a fost introdus într-o cameră adiacentă în ulei mineral, unde filamente fine au fost smulse din nerv și plasate pe un electrod de înregistrare din sârmă de argint.

Câmpurile receptive ale mecanoreceptorilor individuali au fost identificate prin sondarea mecanică a suprafeței pielii cu o tijă de sticlă tocată sau cu o pensă tocată. Ieșirea analogică de la un amplificator Neurolog a fost filtrată și digitizată cu ajutorul sistemului Powerlab 4/30 și a software-ului Labchart 7.1 (ADinstruments). Extensia Spike-histogramă pentru Labchart 7.1 a fost utilizată pentru a sorta vârfurile unităților individuale. Stimulii electrici (1 Hz, impulsuri pătrate de 50-500 ms) au fost administrați la câmpurile receptive ale unei singure unități pentru a măsura viteza de conducere și a permite clasificarea ca fibre C (viteză <1,2 m s-1), fibre Aδ (1,2-10 m s-1) sau fibre Aβ (>10 m s-1). Stimularea mecanică a câmpurilor receptive ale neuronilor a fost realizată utilizând un actuator piezo (Physik Instrumente, nr. de catalog P-841.60) și un Nanomotor cu două capete (Kleindiek Nanotechnik, nr. de catalog MM-NM3108) conectat la un dispozitiv de măsurare a forței (Kleindiek Nanotechnik, nr. de catalog PL-FMS-LS). Măsurătorile de forță calibrate au fost achiziționate simultan cu ajutorul sistemului Powerlab și a software-ului Labchart în timpul experimentului (Extended Data Fig. 10).

Deoarece diferite tipuri de fibre au proprietăți diferite de reglare a stimulilor, au fost utilizate diferite protocoale de stimuli mecanici în funcție de tipul de unitate. Fibrele Aβ cu prag scăzut (RAMs și SAMs) și fibrele Aδ D-hairs au fost stimulate cu actuatorul piezo cu trei stimuli de vibrație (5 Hz, 25 Hz și 50 Hz, distorsiunile introduse de senzorul de forță în serie au împiedicat utilizarea frecvențelor >50 Hz) cu o amplitudine crescândă în șase trepte (amplitudini de la vârf la vârf de ~6-65 mN; 20 de cicluri pe treaptă), și o secvență de stimuli dinamici cu patru forme de undă de tip „ramp-and-hold” cu viteze variabile de deflexie a sondei (durată de 3 s; 0.075, 0,15, 0,45 și 1,5 mm s-1; amplitudine medie de 100 mN). SAM-urile și RAM-urile din fibrele Aβ au fost clasificate prin prezența sau absența tragerii în timpul fazei statice a unui stimulent de tip ramp-and-hold, respectiv, așa cum a fost descris anterior20,21. Unitățile unice au fost stimulate suplimentar cu o serie de cinci stimuli mecanici statici cu forme de undă de tip „ramp-and-hold” de amplitudine crescândă (durata de 3 s; variind de la ~10 mN la 260 mN). SAM-urile cu prag scăzut, fibrele Aδ cu prag ridicat și fibrele C au fost, de asemenea, stimulate cu ajutorul nanomotorului cu cinci stimuli de tip rampă și menținere cu amplitudini crescânde20.

Înregistrări de unități unice de la aferenții Pacinieni

Pentru a evalua mecanosensibilitatea corpusculilor Pacinieni localizați în jurul fibulei, pielea și toți mușchii au fost îndepărtați din partea inferioară a piciorului și nervul interosos a fost disecat liber de membrana interosoasă. Ulterior, peroneul și tibia, care la șoareci sunt fuzionate de-a lungul jumătății lor distale, au fost îndepărtate de pe animal, împreună cu nervul interosos, și au fost transferate într-o cameră de baie de organe personalizată, unde au fost montate cu ajutorul unui mini-vice personalizat. Întreaga procedură de disecție a fost efectuată în tampon de disecție rece ca gheața, care conținea 108 mM N-metil-d-glucamină, 20 mM Hepes, 3,5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM gluconat de sodiu, 5,5 mM glucoză, 18,5 mM zaharoză și 0,5 mM CaCl2 (ajustat la pH 7,4 cu NaOH). 7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM gluconat de sodiu, 5,5 mM glucoză, 7,5 mM zaharoză și 1,5 mM CaCl2 (ajustat la pH 7,4 cu NaOH), iar capătul proximal al nervului interosos a fost transferat într-o cameră de înregistrare umplută cu ulei prin introducerea acestuia printr-o gaură mică (~1 mm diametru) care făcea legătura între camera de baie a organului și camera de înregistrare adiacentă. După îndepărtarea perineului, filamentele individuale au fost disecate liber și atașate la electrodul de înregistrare pentru înregistrarea potențialului de acțiune. Înregistrările au fost efectuate cu sistemul Neurolog (Digitimer Ltd, nr. de catalog NL100AK și NL104A) și cu un PowerLab 4SP controlat de LabChart 7.1 (AD Instruments). Pentru a determina pragul de activare mecanică și acordajul de frecvență al aferențelor Pacinian, o serie de stimuli mecanici sinusoidali (durata 1 s; amplitudine crescând liniar damp/dt = 30 µm s-1; amplitudine maximă 30 µm) cu frecvențe crescânde (40-480 Hz) a fost aplicată la capătul distal al fibulei cu o tijă metalică (diametrul vârfului 1 mm) care a fost atașată la un actuator piezoelectric (Physik Instrumente GmbH, catalog nr. P-840.2).

T Sarcina de învățare a percepției vibrațiilor la șoareci

În primul rând, pentru implantarea rezemătoarei de cap, șoarecii au fost anesteziați cu izofluran (1,5-2% în O2) și injectați subcutanat cu metamizol (200 mg pe kg de greutate corporală). Un suport metalic ușor a fost implantat pe craniu cu lipici (UHU dent) și ciment dentar (Paladur). Temperatura șoarecilor a fost monitorizată cu o sondă rectală și a fost menținută la 37 °C cu ajutorul unui tampon de încălzire. Șoarecii au fost apoi plasați în cușca lor de acasă cu metamizol (200 mg ml-1) în apa de băut. Șoarecii implantați au fost obișnuiți cu imobilizarea capului la 3-5 d după operație. Șoarecii au fost obișnuiți treptat în configurația comportamentală la fixarea capului. Apoi, la 1 d după începerea restricției de apă, șoarecii au fost supuși la două sesiuni de împerechere în zile consecutive.

În timpul sesiunilor de împerechere (cu o durată de 30 până la 45 de minute), recompensele cu apă au fost oferite de la o gură de apă, asociate cu prezentarea stimulului de vibrație (durata de 3 s, 5 Hz, 60 mN) la nivelul pielii glabre a labei anterioare pentru a crea o asociere între stimul și recompensă. Stimululul de vibrație a fost administrat laba piciorului prin intermediul unei tije de sticlă amortizoare personalizate, de 2 mm2 , atașată la un actuator piezoelectric (PICMA de la Physik Instrumente, nr. de catalog PL127.11). O relație tensiune-forță a fost calibrată prin utilizarea unui sistem de măsurare a forței (Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific) pentru a măsura profilul de forță sinusoidal aplicat de dispozitivul piezoelectric după fiecare experiment. Este posibil ca dispozitivul de acționare piezoelectrică de îndoire utilizat să fi adăugat un anumit zgomot armonic în comparație cu alte sisteme piezoelectrice suprapuse. Cu toate acestea, calibrarea piezo în fiecare experiment a asigurat faptul că deficitele substanțiale în percepția tactilă a șoarecilor cu deficiență Ush2a era puțin probabil să fie un artefact tehnic.

După împerechere, au început sesiunile zilnice de antrenament în timpul cărora șoarecii au primit o mică recompensă de apă (4-7 μl) de la gura de scurgere atunci când au lins corect în timpul unei ferestre de oportunitate la începutul stimulului (3,5 s). Încercările de captură, în care nu a fost prezentat niciun stimulent și lingerile au fost numărate ca alarme false, au fost intercalate ca 50% din numărul total de încercări. Încercările nu au fost indicate de niciun eveniment sau stimul extern, așa cum a fost descris anterior10 și au fost prezentate la intervale de timp randomizate între 3 și 30 s. Dacă șoarecii lingeau în timpul unei ferestre de 2 s înainte de debutul stimulului, a fost impusă o întârziere de 3 până la 30 s pentru a promova asocierea stimulului cu recompensa apei. O sesiune de antrenament a constat din aproximativ 60 de încercări (30× stimul + 30× captură). S-au comparat ratele de reușită și de alarmă falsă pentru a evalua performanța în timpul sesiunilor de antrenament. Pentru a testa faptul că șoarecii se lingeau ca răspuns la stimulul de vibrație al labei anterioare, la sfârșitul antrenamentului a fost inclusă o sesiune în care dispozitivul de stimulare a fost mutat la 3-5 mm sub laba piciorului, astfel încât să nu se realizeze niciun contact cu pielea. În zilele experimentale următoare, după ce șoarecii au învățat cu succes sarcina, stimulii de vibrație au fost administrați cu amplitudini și frecvențe diferite. Pentru vibrația de 5 Hz, au fost utilizate forțe de 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN și 6 mN pentru a stimula laba anterioară, cu două amplitudini diferite intercalate cu încercări de captură în fiecare zi. De exemplu, stimulii de 48 mN și 24 mN și încercările de prindere au fost intercalate în timpul unei sesiuni, care a constat din aproximativ 100 de încercări (33× stimul de 48 mN + 33× stimul de 24 mN + 34× prindere). Stimulii 6-mN au fost testați pe parcursul a două sesiuni. Pentru vibrațiile de 25-Hz și 125-Hz, forțele de 60-mN și 12-mN de aceeași frecvență au fost intercalate cu încercări de prindere, în același mod, pe parcursul a două sesiuni de testare.

Sesizare comportamentală de inhibiție a impulsurilor pereche la șoareci

Răspunsul de tresărire al șoarecilor a fost evaluat cu ajutorul sistemului Startle Response (SR-LAB, San Diego Instruments). Șoarecii au fost obișnuiți cu aparatul timp de 30 min în fiecare zi timp de 3 d înainte de testare. Pe scurt, răspunsurile de startle ale șoarecilor au fost măsurate pe un total de 48 de încercări cu impulsuri singure45 (durata de 40 ms, 129 dB) și încercări cu preimpuls + impuls (preimpuls de 20 ms de 69, 73 sau 81 dB). Testele cu preimpuls au avut loc cu 200 ms înainte de testele cu impulsuri. Procentul de inhibiție a impulsurilor împerecheate (% PPI) pentru fiecare intensitate a preimpulsului a fost calculat ca %PPI = 100 × ((impuls singur) – (preimpuls + impuls))/impuls singur.

Sesizări comportamentale cu vFh de șoarece și perie

Soarecii au fost obișnuiți cu mediul de testare timp de 30 de minute în fiecare zi timp de 3 zile înainte de testare. În zilele experimentale, șoarecii au fost plasați în cabine individuale din plexiglas pe o platformă de plasă înălțată. Pentru testul cu peria, laba posterioară stângă a fost mângâiată de la călcâi la degete cu o perie de vopsea cu cap de 2 mm 10× la intervale aleatorii. S-a calculat procentul de retrageri. În zilele de testare ulterioare, pragurile de retragere nocivă mecanică au fost măsurate cu ajutorul vFhs. Pe scurt, suprafețele plantare ale labei posterioare stângi au fost stimulate cu filamente de vFh, iar pragul reflex a fost determinat prin utilizarea metodei sus-jos46. În funcție de răspunsul animalului, s-au aplicat vFhs de forță mai mare sau mai mică pe laba posterioară pentru a stabili o serie de șase până la nouă retrageri reflexe pozitive sau negative. Acest model de răspunsuri a fost apoi convertit astfel încât datele să fie exprimate ca logaritm al mediei pragului de retragere reflexă de 50%46.

Analiza datelor psihofizice umane

Datele au fost testate pentru normalitate, iar diferențele de performanță psihofizică pentru fiecare test între participanții de control și pacienții cu sindrom Usher au fost comparate folosind testele t Student nepereche sau testele Mann-Whitney U. Transformările z au fost utilizate pentru a compara profilurile de date individuale unice cu media și s.d. ale controlului sănătos. Scorul z a fost calculat cu ajutorul foilor de calcul Excel pe baza formulei z = (scorul pacientului – media grupului pe s.d. din media grupului). Valorile z >0 indică un câștig de funcție, ceea ce înseamnă că participantul este mai sensibil la stimulii testați în comparație cu martorii sănătoși. Pot fi identificate scorurile z individuale care se află în afara intervalului de încredere de 95% (adică scorul z <1,96 sau >1,96 s.d.) din setul de date al controalelor sănătoase. Performanța în fiecare test a fost testată în comparații pe perechi folosind testul Mann-Whitney U și am considerat că P < 0,01 este semnificativ din punct de vedere statistic.

Analiză de date a comportamentului de vibrație al șoarecilor

Lucrările au fost înregistrate cu un senzor la vârful gurii de recompensă a apei. În studiile de stimulare, o lovitură a fost socotită atunci când a existat o lingere în fereastra de oportunitate (3,5 s) după începerea stimulului. Datele comportamentale au fost colectate utilizând rutine personalizate în Lab View la o rată de eșantionare de 1 kHz, iar pentru analiză au fost utilizate scripturi Python personalizate. În timpul încercărilor de prindere, o alarmă falsă a avut loc atunci când a existat o lingere în timpul unei ferestre de oportunitate la fel de lungi. Pentru a evalua dacă șoarecii au învățat cu succes sarcina de detectare, ratele de reușită au fost comparate cu ratele de alarmă falsă în cadrul aceleiași sesiuni de antrenament, utilizând analiza de varianță (ANOVA) cu măsuri repetate în două direcții, cu testarea post-hoc a lui Bonferroni.

Pentru a cuantifica performanța în sarcinile de detectare, am folosit d’ (indicele de sensibilitate) în loc de procentul de încercări corecte pentru a lua în considerare părtinirea în criteriile de lins47. Pentru a calcula d’, s-a utilizat următoarea formulă: d’ = z(h) – z(fa), unde z(h) și z(fa) reprezintă inversul normal al funcției de distribuție cumulativă a ratelor de succes și, respectiv, de alarmă falsă. Pentru a evita valorile infinite ale lui d’, atunci când toate încercările au fost raportate (rata = 1) sau niciuna nu a fost (rata = 0), ratele au fost înlocuite cu (1½N) sau, respectiv, (½ N), unde N este numărul de încercări în care a fost prezentat stimulul48. Scorurile z pentru ratele de succes și de alarmă falsă au fost calculate utilizând OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) cu funcția NORMINV. Am efectuat teste statistice numai pe datele în care cel puțin unul dintre genotipuri prezintă d’ > 1,0, ceea ce indică faptul că acești șoareci au raportat stimulul. Datele comportamentale au fost colectate utilizând rutine personalizate în Lab View la o rată de eșantionare de 1 kHz, iar pentru analiză au fost utilizate scripturi Python personalizate. Codurile și scripturile personalizate sunt disponibile la cerere; mai multe informații sunt disponibile în Nature Research Reporting Summary asociat cu acest manuscris.

Comportamentele de lins au fost calculate și reprezentate grafic ca probabilitate de lins, frecvența primei linsori (Hz) sau latența medie a primei linsori (s). Aceste măsuri au fost calculate după cum urmează: probabilitatea de lins este probabilitatea ca un șoarece să se lingă cel puțin o dată în timpul ferestrei de oportunitate într-o încercare de stimulare sau de prindere (încercări cu cel puțin 1 lins / total încercări). În PSTH-urile primelor linsuri, prezentăm distribuția pe grupe a latențelor primelor linsuri în studiile de stimulare sau de prindere. Pentru a normaliza aceste date între șoareci, am împărțit numărul de prime lingeri la numărul total de încercări. Prin împărțirea valorii primei lingeri la lățimea binului, am calculat valoarea în hertz (lingeri pe s). Latența medie a primei linsături (s) a fost calculată prin adăugarea latențelor primei linsături în fiecare încercare de lovire și împărțind-o la numărul total de încercări.

Analiză de date a înregistrărilor de pregătire a nervilor pielii

Unitățile cutanate ale labei anterioare și ale labei posterioare au fost clasificate pe baza vitezei de conducere și a răspunsurilor la stimuli mecanici. Pragurile mecanice ale unităților au fost calculate ca fiind temperatura sau amplitudinea mecanică necesară pentru a declanșa primul potențial de acțiune. Toate analizele statistice au fost efectuate utilizând GraphPad Prism 6.0 și Python. Testele statistice includ ANOVA cu măsurători repetate în două direcții cu testul post-hoc al lui Bonferroni, testele t ale lui Student, testele Mann-Whitney U și testele cu perechi potrivite ale lui Wilcoxon. Testele Kolmogorov-Smirnov au fost utilizate pentru a evalua normalitatea datelor. Asteriscurile din figuri indică semnificația statistică: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Analiza datelor de microscopie electronică a nervilor de șoarece

Pentru analiza micrografiilor electronice ale nervului sciatic de șoarece, numărul fibrelor mielinizate și nemielinizate a fost numărat în 12 secțiuni per nerv. Numerele totale de fibre per nerv au fost apoi extrapolate din suprafața secțiunii transversale a fiecărui nerv.

Rezumat de raportare

Mai multe informații despre designul cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare al Nature Research legat de acest articol.

.