15 februarie 2010 (Vol. 30, Nr. 4)

Scott B. Mohler

Pași simpli pentru o imagistică bioluminescentă reușită a animalelor

Luciferina este substratul de bază al testelor bioluminescente. Bazată pe o reacție simplă în care ATP alimentează cataliza luciferazei luciferinei licuriciului (cărăbușului) pentru a produce lumină, bioluminescența are aplicații largi. Utilizarea sa ca indicator de biomasă permite detectarea microorganismelor în produsele de consum, pe suprafețele instalațiilor de producție și a fost chiar folosită pentru a determina dacă există viață pe Lună și pe Marte.

Bioluminiscența este utilizată în monitorizarea in vitro și in vivo a proceselor biologice, inclusiv a expresiei genice și a interacțiunilor proteină-proteină. Luciferina este utilizată, de exemplu, în testele cu gene reporter pentru a studia reglarea și funcția genelor, în care expresia reporterului marcat cu luciferină este un marker pentru a indica preluarea cu succes a genei de interes în tehnicile de ADN recombinant. Ca reactiv de detecție, reacția luciferină-luciferază este utilizată în pirozecvenție pentru a realiza o detecție rapidă a bazelor în sistemele actuale de secvențiere a ADN-ului de mare randament.

Mai recent, imagistica prin bioluminescență a apărut ca o tehnică puternică pentru studiul direct al diferitelor populații de celule la animale mici vii, cum ar fi șoarecii. În această tehnică, celulele (de exemplu, celulele canceroase, celulele stem, celulele T) sunt proiectate să exprime luciferaza și să se lumineze. Vizualizarea neinvazivă la animale vii cu ajutorul unei camere sensibile cu dispozitiv de cuplaj de sarcină face astfel posibilă observarea în timp real a progresiei și regresiei bolii în diferite momente pe parcursul tratamentului terapeutic. Angajată pentru a înțelege bazele moleculare ale unor patologii cum ar fi tulburările neurodegenerative, tulburările cardiovasculare, obezitatea și cancerul, această tehnică este de o valoare imensă pentru dezvoltarea clinică, de diagnostic și de medicamente.

Cercetătorii de la Regis Technologies au identificat punctele slabe comune în testele cu luciferază. Problemele apar adesea înainte ca testul să înceapă. Luciferina de licurici este o moleculă sensibilă și chiar și experimentele bine planificate pot da rezultate eronate dacă luciferina este manipulată greșit și deteriorată înainte de utilizare. În acest articol, descriem sarea optimă, puritatea, manipularea și depozitarea luciferinei pentru a asigura rezultate reușite și consecvente în imagistica animală și în alte teste.

Considerații privind achiziția

Cercetătorii se întreabă adesea ce formă de luciferină să folosească. Sărurile de potasiu și de sodiu ale luciferinei sunt de obicei folosite interschimbabil. Cu toate acestea, dizolvarea moleculei este un factor important de luat în considerare pentru anumite teste. Sarea de sodiu este mai solubilă în apă (>100 mg/mL) decât sarea de potasiu (55 mg/mL). Forma de acid liber, deși este încă disponibilă, nu este adesea utilizată din cauza dificultății sale de dizolvare.

Pentru că câteva impurități pot avea un impact asupra experimentelor în moduri diferite, puritatea inițială a reactivului poate fi un aspect important.

L-luciferina, un enantiomer al D-luciferinei (figura 1), este o impuritate cunoscută în luciferina sintetică. Deși s-a demonstrat că funcționează în reacțiile de luciferază, este posibil să apară o deplasare semnificativă a vârfului de emisie de lumină în funcție de parametrii de colectare a datelor utilizați. L-luciferina este ușor de detectat și cuantificat prin HPLC chiral și ar trebui să fie raportată în certificatul de analiză al producătorului. Cea mai mare parte a luciferinei ar trebui să conțină mai puțin de 0,5 % L-luciferină, deși limite mai mari pot fi probabil tolerate atâta timp cât nivelurile de L-luciferină rămân constante pe parcursul experimentului.

Dehidroluciferina (figura 1) este o impuritate care acționează ca un inhibitor al luciferazei, suprimând înălțimea flash-ului și integrarea totală. O probă dopată cu 1% dehidroluciferină prezintă mai puțin de jumătate din înălțimea flashului și mai puțin de 25% din integrarea totală pe parcursul a 15 minute. Dehidroluciferina se poate forma în timpul sintezei sau depozitării luciferinei. Selectarea unui producător care furnizează niveluri scăzute de dehidroluciferină va contribui la asigurarea unor rezultate fiabile și repetabile.

Multe urme de impurități comune din sinteza luciferinei pot inhiba alte enzime în sisteme complexe și pot cauza variabilitate experimentală din cauza diferențelor de la lot la lot sau de la producător la producător.

Figura 1. Comparație structurală a D-luciferinei și a impurităților

Stocare

Luciferina este sensibilă la lumină, oxigen și umiditate și trebuie să fie protejată. Lumina și oxigenul pot cataliza oxidarea luciferinei în dehidroluciferină. Lăsată într-o sticlă de chihlimbar sub azot la temperatura camerei, luciferina va începe să se descompună în dehidroluciferină după o lună (figura 2), dar este stabilă într-o sticlă nedeschisă timp de cel puțin doi ani într-un congelator. Dizolvată în apă cu suficient oxigen, luciferina se va transforma în dehidroluciferină în doar câteva zile.

Luciferina trebuie achiziționată și depozitată în cea mai mică cantitate posibilă pentru a preveni descompunerea în dehidroluciferină în urma multiplelor cicluri de congelare-dezghețare-deschidere. Dacă este achiziționat în vrac, împărțirea reactivului de luciferină în flacoane de chihlimbar de unică folosință va contribui la asigurarea stabilității. Depozitarea pe termen lung sub formă de soluție congelată nu este recomandată pentru aplicații sensibile, cum ar fi studiile pe animale întregi. Pentru a ajuta la încetinirea descompunerii în soluțiile congelate, pulverizați soluția cu azot sau argon înainte de congelare.

Figura 2. Descompunerea luciferinei în dehidroluciferină în funcție de timp la 25ºC și -20ºC

Manipulare

Când este deschis, flaconul de luciferină trebuie lăsat să ajungă complet la temperatura camerei și apoi purjat cu azot sau argon înainte de a fi resigilat. În cazul în care soluțiile de luciferină urmează să fie utilizate în câteva ore, sunt necesare puține precauții. Soluțiile care vor fi utilizate pe parcursul unei zile trebuie să fie purjate cu azot sau argon. Soluțiile nu ar trebui să fie utilizate timp de mai multe zile, deoarece va avea loc formarea dehidroluciferinei.

Scott B. Mohler ([email protected]) este manager de produs la Regis Technologies. Website: www.registech.com.