Raport de caz

Un băiat în vârstă de 5 ani a fost diagnosticat cu leucemie acută limfoblastică în decembrie 1994 și a fost inclus în protocolul Fralle 93. Copilul a obținut o remisiune hematologică la 6 săptămâni după ce a fost inițiată chimioterapia de inducție. El a fost văzut ca pacient ambulatoriu și a răspuns bine la tratament în anii următori. Cu toate acestea, la un consult din martie 1997, pacientul a avut un episod febril când a fost perfuzat cu sistemul Port-a-cath. Examenul clinic nu a arătat nicio localizare septică. Numărul de leucocite a fost de 10.860/ml, cu un număr absolut de neutrofile de 8.850/ml. Un set de hemoculturi a fost recoltat de la Port-a-cath, iar cultura aerobă în sticlă a dat colonii pigmentate în galben de tije gram-pozitive coryneforme. Băiatul a primit ceftriaxonă (1 g) intravenos o dată, urmată de cefadroxil 500 mg de două ori pe zi timp de 7 zile. Din cauza febrei persistente, cefadroxilul a fost administrat timp de încă o săptămână, iar medicamentele imunosupresoare au fost întrerupte în aceeași perioadă. Anamneza pacientului a fost nesemnalată în următoarele 2 luni și nu s-a efectuat nicio hemocultură atunci când a venit la vizitele lunare. În iunie 1997, copilul a fost prezentat la consult ca fiind subfebril și plângându-se de oboseală. Examenul fizic nu a evidențiat niciun focar de infecție, iar numărul de leucocite nu era ridicat. Un set de hemoculturi a fost prelevat din Port-a-cath, iar flaconul aerob a relevat aceleași tije gram-pozitive coryneforme, identificate ulterior ca fiind Microbacterium sp. A fost diagnosticată bacteriemia legată de cateter, iar cateterul venos central a fost îndepărtat. Ampicilina (100 mg/kg/zi) a fost administrată intravenos perioperator, prima doză fiind administrată cu 24 de ore înainte de operație. Starea clinică a pacientului s-a îmbunătățit rapid după aceea. Cateterul Port-a-cath a fost cultivat pe agarul de sânge Columbia. În decurs de 24 de ore la 37°C, s-a dezvoltat o cultură pură de colonii pigmentate în galben de o tijă nefermentativă, gram-pozitivă, oarecum decolorată. Din nefericire, subculturile au fost pierdute și nu au putut fi efectuate alte examinări.

Steaua izolată din culturile de sânge ale pacientului, etichetată CF36, a fost o coryneformă galben-pigmentată, motilă, cu metabolism oxidativ, activitate proteolitică și acizi grași celulari de tip ramificat. Aceste caracteristici generale sunt sugestive pentru genul Microbacterium, care include atât specii fermentative, cât și specii oxidative, acestea din urmă denumite anterior Aureobacterium (13).

Secvența genei 16S ARNr (ADNr) a fost studiată prin utilizarea unui set de primeri pentru amplificare. Produsele PCR au fost purificate de pe gel de agaroză cu un kit de extracție pe gel QIAquick (Qiagen, Westburg, Țările de Jos). Analiza secvenței a fost efectuată cu un secvențiator automat de ADN 3100 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, California), utilizând kitul ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction. Fiecare secvență a fost comparată cu datele de secvență disponibile în bazele de date prin utilizarea BLAST (10). Un arbore filogenetic a fost construit prin metoda de alăturare a vecinilor (8, 11).

Secvențierea ADNr 16S bazată pe 1.490 de nucleotide a tulpinii CF36 a evidențiat cele mai ridicate niveluri de similaritate de 99,5% cu secvența M. luteolum DSM 20143T și 99,3% cu secvența M. oxydans DSM 20578T. De asemenea, a fost strâns înrudită cu secvențele de M. saperdae (99,2%) și M. liquefaciens (99,1%) (Tabelul (Tabelul1).1). Alte patru tulpini similare au fost colectate din diverse probe de la alți pacienți care au fost etichetate CF7 izolată dintr-o hemocultură, CF34 dintr-un aspirat bronșic, CF130 dintr-o hemocultură și CF40 dintr-o sursă umană necunoscută. O tulpină suplimentară, CF128, a fost obținută dintr-o probă vegetală. Cele cinci tulpini au prezentat secvențe de ADNr 16S similare cu cele ale tulpinii tip de M. oxydans, cu o similaritate cuprinsă între 99,3 și 99,4%, în timp ce rata de similaritate cu CF36 a fost cuprinsă între 99,9 și 100%. Alte nouă izolate clinice au prezentat o similitudine de 99,9 până la 100% cu tulpina tip de M. oxydans.

Aceste rezultate ne-au determinat să realizăm un studiu extins al următoarelor șase tulpini: CF36, CF7, CF34, CF40, CF128 și CF130.

Acizii grași celulari, determinați așa cum au fost descriși anterior (14), au arătat același profil în toate tulpinile. Procentele medii ale principalilor acizi grași celulari au fost după cum urmează: 40,3% anteiso-C15:0 (interval, 37,1 până la 46,0%), 27% anteiso-C17:0 (interval, 22,9 până la 31,3%), 15,7% izo-C16:0 (interval, 13,8 până la 19,3%), 9,3% izo-C15:0 (interval, 4,6 până la 13,9%), și 4,2% izo-C17:0 (interval, 3,0 până la 7,2%).

Analiza peptidoglicanului din peretele celular CF36 și CF7 a fost efectuată la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germania) de către N. Weiss cu o metodă de cromatografie în strat subțire, așa cum a fost descrisă de Schleifer și Kandler (12). Peptidoglicanul a fost de tip B2β cu d-ornitină ca diaminoacid.

Hibridizarea ADN-ADN a fost efectuată de P. Schumann la DSMZ așa cum a fost descrisă de De Ley și colab. (3) cu modificările lui Escara și Hutton (4) și Huss și colab. (7). Rata de omologie ADN a CF36 cu M. luteolum LMG 16207T a fost de numai 33,7%, iar cea cu M. oxydans DSM 20578T a fost de 46,6%, dar s-au obținut niveluri ridicate de înrudire ADN de 78,1, 81,8 și 78,2% cu tulpinile CF7, CF34 și, respectiv, CF40. Acest lucru a fost în concordanță cu atribuirea lor la o singură specie. Conținutul de G+C al ADN-ului tulpinii CF36 a fost de 69,9 mol%, așa cum a fost determinat la DSMZ.

Cele șase tulpini au fost tije gram-pozitive, motile, coryneforme. Ele au crescut bine pe agarul de sânge Columbia la 37°C, iar culoarea coloniilor a fost galbenă. Tulpinile au fost strict aerobe, catalază pozitivă și oxidază negativă. Acestea au fost capabile să hidrolizeze esculina și gelatina. Deși secvențierea ADNr 16S a arătat relații apropiate cu M. luteolum, M. saperdae și M. liquefaciens, aceste specii erau destul de diferite din punct de vedere fenotipic. Niciuna dintre ele nu a crescut la 37°C, M. luteolum și M. liquefaciens nu erau mobile, iar M. luteolum și M. saperdae erau neproteolitice. Aceste constatări sunt în concordanță cu datele din literatura de specialitate (2). Proprietățile fenotipice ale tulpinilor au fost cele mai asemănătoare cu cele ale lui M. oxydans. Glucoza a fost acidificată prin oxidare pe agarul roșu de fenol cu conținut scăzut de pptonă (15). Toate tulpinile au crescut la 40 °C, în timp ce niciunul dintre izolatele M. oxydans nu a fost capabil să crească la această temperatură. În plus, salicina nu a fost acidificată, spre deosebire de M. oxydans. Noile tulpini au putut fi, de asemenea, diferențiate de M. oxydans cu ajutorul benzilor de asimilare API 50CH (bioMérieux). Lactoza a fost utilizată, iar 2-cetogluconatul nu a fost utilizat, în timp ce M. oxydans a avut reacții opuse. Atunci când s-au folosit benzile API ZYM (bioMérieux), reacțiile negative pentru lipaza esterazei (C8), α-chimotripsină și β-glucozidază au separat cele șase tulpini de M. oxydans. Caracteristicile fenotipice care diferențiază noile tulpini de specii înrudite de Microbacterium oxidative, mobile și proteolitice care cresc la 37°C sunt raportate în tabelul 22.

Sensibilitatea la antibiotice a fost testată pe agar Mueller-Hinton cu benzi E-test (PDM, Solna, Suedia). Intervalele CMI (micrograme pe mililitru) au fost următoarele: penicilină, de la 1,5 la 2; ampicilină, de la 1 la 1,5; cefotaxime, de la 3 la 6; cefalotină, de la 16 la 24; ciprofloxacină, de la 1 la 1,5; gentamicină, de la 2 la 3; vancomicină, de la 3 la 4; claritromicină, <0,016.

Studiile fenotipice, chimiotaxonomice și genetice sugerează că cele șase tulpini studiate aparțin genului Microbacterium, dar constituie o nouă specie, pentru care se propune denumirea Microbacterium paraoxydans și care este strâns înrudită cu M. oxydans, M. saperdae, M. luteolum și M. liquefaciens (Fig. (Fig.11).

Doar câteva rapoarte se ocupă de izolarea speciilor de Microbacterium din material clinic. Majoritatea au fost inițial atribuite grupului CDC A-4 sau A-5 și chiar și izolatele mai recente au fost rareori identificate la nivel de specie (1, 5, 6, 9). Doar într-un număr mic de cazuri, izolatul s-a dovedit a fi agentul cauzal al infecției. Un caz de endoftalmită cauzată de o Microbacterium a fost raportat de Funke et al. și, pe baza secvențierii ADNr 16S, s-a considerat că tulpina aparținea unei specii nedescrise (6). Într-un studiu privind Microbacterium spp. întâlnite în specimene clinice, mai multe tulpini au fost identificate ca fiind M. arborescens și M. imperiale, dar nu s-a efectuat nicio confirmare genetică (5). Un focar nosocomial de bacteriemie legată de Microbacterium a fost raportat la pacienții cu cancer, dar organismul cauzal nu a fost identificat la nivel de specie. Un cateter venos central a fost principalul factor de risc în acel studiu (1). Mai recent, au fost raportate două cazuri de bacteriemie cu Microbacterium legată de cateter, identificate prin secvențierea ADNr 16S. Un izolat a fost înrudit în proporție de 99,4 % cu M. oxydans, iar celălalt a fost înrudit în proporție de 98,7 % cu M. trichothecenolyticum, dar nu s-a reușit o identificare formală la nivel de specie (9).

Strainul CF36 a fost izolat din hemoculturile pacientului la un interval de câteva săptămâni și, deși organismul izolat din cateterul îndepărtat nu a putut fi identificat decât parțial, este probabil ca bacteriemia repetată să fi fost legată de cateter, confirmând faptul că cateterele intravasculare reprezintă un factor de risc de infecție cu aceste organisme. Originea lor poate fi pielea pacientului, dar, deoarece habitatul natural al microbacteriilor este mediul inanimat, nu poate fi exclusă posibilitatea ca lichidul de perfuzie contaminat să fi însămânțat cateterul pacientului.

În ultimele decenii, am colectat în laboratorul nostru 30 de izolate de Microbacterium de origine umană. Toate aceste tulpini au fost identificate printr-un set de caracteristici fenotipice și chemotaxonomice și prin secvențierea ADNr 16S. M. oxydans a fost, de departe, cea mai frecvent izolată specie, reprezentând aproximativ o treime din tulpini (9 din 30), urmată de M. paraoxydans (5 tulpini); M. aurum și M. lacticum au fost reprezentate fiecare de 4 tulpini. Celelalte opt tulpini rămase au fost dispersate în mai multe specii, cu un izolat de M. foliorum, un izolat de M. schleiferi, un izolat de M. testaceum și cinci izolate care nu se încadrau în nicio specie descrisă.

Deși microbacteriile sunt rareori implicate în boli umane, numărul de izolate relevante găsite în mediile nosocomiale este în creștere. Deși au fost recunoscute mai mult de 30 de specii în acest gen, este probabil ca doar un număr limitat dintre acestea să fie izolate din probe clinice. O identificare mai precisă a izolatelor umane ne poate ajuta să înțelegem mai bine ce specii sunt predispuse să devină agenți patogeni oportuniști.

.