Leishmanioza canină (CanL) este o infecție/boală protozoară cauzată de Leishmania infantum (sinonime: Leishmania chagasi; Leishmania infantum chagasi) foarte răspândită în toate țările din regiunile mediteraneene, caucaziene și din Orientul Mijlociu ale Lumii Vechi, precum și în mai multe teritorii din America Latină (Dantas-Torres et al., 2012). Rezultatele infecției la câini variază de la subclinic la clinic și de la boala ușoară la cea severă. Deși parazitul poate fi transmis ocazional prin moduri nonvectoriale (EFSA Panel on Animal Health and Welfare, 2015), principala cale de transmitere este reprezentată de muștele de nisip flebotomine infectate prin mușcătura acestora. De la aproximativ 7 zile după o masă de sânge infectat, vectorii competenți pot dezvolta promastigoturi infecțioase de Leishmania în foregut, care sunt regurgitate în pielea mamiferului gazdă în timpul mesei de sânge ulterioare (Bates, 2007). Atât câinii subclinici, cât și câinii bolnavi pot fi infecțioși pentru vectori; cu toate acestea, probabilitatea de a contribui în mod disproporționat la transmiterea ulterioară (efectul de „super-spreader”) crește odată cu durata și gravitatea CanL (Courtenay et al., 2014).

Phlebotomus perniciosus este principalul vector competent al L. infantum în tot bazinul mediteranean vestic, inclusiv în sudul Europei și în nord-vestul Africii (Centrul european pentru prevenirea și controlul bolilor, 2019). În plus, P. perniciosus este un membru reprezentativ al unui grup taxonomic mai mare, subgenul Larroussius, format din specii apropiate din punct de vedere morfologic, genetic și biologic care acționează ca vectori competenți ai L. infantum în centrul și estul Mediteranei, cum ar fi Phlebotomus neglectus și Phlebotomus tobbi (Alten et al., 2016). Utilizarea piretroizilor topici este considerată în mod universal abordarea de primă linie pentru a proteja câinii sănătoși împotriva mușcăturilor de muște de nisip infectate cu Leishmania (Maroli et al., 2010), în timp ce gestionarea câinilor infectați/infecțioși este o sarcină complexă din cauza lipsei unui consens larg în ceea ce privește abordarea care trebuie adoptată. În mod ideal, îngrijirea veterinară individuală pentru gestionarea patologiei CanL ar trebui să fie combinată cu măsuri care urmăresc să împiedice răspândirea parazitului prin intermediul vectorului. Aceasta din urmă este deosebit de importantă ca parte a programelor de control al VL zoonotice întreprinse în prezent în mai multe țări endemice. Pe de o parte, proprietarii sunt reticenți în a investi în produse piretroide pentru câinii deja infectați sau bolnavi; pe de altă parte, terapiile antileishmaniene au doar o eficacitate temporară pentru a reduce în mod constant infecțiozitatea unui câine cu muște de nisip (Miró et al., 2017). Isoxazolinele sunt o clasă nouă de compuși care vizează sistemul nervos central și joncțiunile neuromusculare ale artropodelor vectoare prin blocarea canalelor de clorură cu ligand-gat, provocând astfel moartea artropodului (Weber & Selzer, 2016). O serie de compuși au fost autorizați ca medicamente de uz veterinar pentru protecția animalelor de companie împotriva puricilor și căpușelor, cu timpi de înjumătățire îndelungată in vivo, care asigură săptămâni sau luni de protecție după o singură administrare orală (Kilp et al., 2014; Shoop et al., 2014). Aceste proprietăți au atras atenția asupra potențialului de utilizare a izoxazolinelor pentru controlul bolilor umane transmise prin vectori (Miglianico et al., 2018). În ceea ce privește insectele zburătoare, s-a constatat că atât gradul, cât și durata eficacității insecticide diferă între medicamentele izoxazoline disponibile în comerț atunci când sunt administrate la câini, cum ar fi împotriva Triatoma infestans (Loza et al., 2017) sau a muștelei de nisip Phlebotomus papatasi (Gomez et al., 2018a), fluralanerul (Bravecto®; Merck Animal Health) s-a dovedit a fi cel mai activ compus în ceea ce privește parametrii de eficacitate de mai sus. Recent, un studiu clinic privind tratamentul cu fluralaner la câini împotriva muștelor de nisip a utilizat P. papatasi colonizat ca specie țintă (Gomez et al., 2018b). Cu toate acestea, este posibil ca această specie să nu fie considerată un model adecvat pentru muștele de nisip. Acest lucru se datorează în primul rând faptului că P. papatasi nu este un vector competent de L. infantum, fiind refractar la dezvoltarea intestinală a acestui parazit. În plus, studiile anterioare privind piretroizii topici canini (Maroli et al., 2010) sugerează că P. papatasi ar putea fi mai puțin sensibilă la compușii care vizează sistemul nervos central al muștelor de nisip decât P. perniciosus. De exemplu, o formulare punctiformă cu 50% permetrin-10% imidacloprid a ucis 29% din P. papatasi față de 49% din P. perniciosus. Aceste considerente ne-au determinat să determinăm debutul și durata eficacității insecticidului împotriva P. perniciosus după hrănirea câinilor tratați cu fluralaner.

S-a efectuat un studiu de eficacitate conceput în grupuri paralele, controlat negativ, randomizat, orbit, cu un singur centru. Câinii experimentali, constând în câini Beagle masculi cu vârsta ≥ 6 luni la momentul includerii, proveneau dintr-o colonie de cercetare din Mohammedia, Maroc; studiul în faza de viață a fost efectuat la facilitățile Clinvet. Exemplarele adulte de P. perniciosus proveneau dintr-o tulpină spaniolă menținută începând din iunie 2012 în instalațiile de entomologie medicală ale Istituto Superiore di Sanità, Italia, la o temperatură de 28 ± 1 °C și o umiditate relativă de 75-80 %. Muștele de nisip au fost certificate pentru statutul de „fără agenți patogeni” și au fost adaptate la condiții de reproducere în masă cu șase sublinii de colonii independente. Exemplarele în vârstă de trei până la 9 zile au fost adunate din cuștile emergente respective și distribuite în proporții similare de vârstă în vase cilindrice de plastic (400 ml) prevăzute cu un capac etanș, care a fost perforat, iar gaura a fost acoperită cu un tifon fin care susținea o bucată de bumbac îmbibată cu soluție saturată de glucoză. Numărul de muște de nisip din fiecare vas a fost suficient pentru un câine, la care s-au adăugat câteva exemplare suplimentare pentru a compensa decesele survenite înainte de experimente. Ghivecele au fost puse în pungi de plastic ermetice prevăzute cu hârtie de filtru umezită. Ambalajul secundar a constat dintr-un recipient preîncălzit prevăzut cu un dispozitiv de stabilitate extinsă a temperaturii și un înregistrator digital de temperatură, înconjurat de o cutie de carton robustă. Cutiile au fost expediate în Maroc pe calea aerului, iar livrarea a avut loc în aproximativ 3 zile de la expediere. La livrare, s-a verificat înregistrarea temperaturii, iar pungile de plastic au fost lăsate nedeschise la 25 ± 3 °C până la expunerea câinilor. O evaluare aproximativă a mortalității muștelor de nisip în ghivece a fost efectuată din exterior, iar o rată de mortalitate de ≤ 10 % pe ghiveci a fost considerată acceptabilă pentru utilizare. În cele din urmă, la momentul experimentelor, fiecare câine a fost expus la aceeași populație omogenă de muște de nisip cu vârsta de 7-14 zile.

Cu 27 de zile înainte de tratament, 14 câini Beagle masculi au fost sedați cu Domitor® (Vetoquinol, Lure, Franța) și capul lor a fost expus timp de 1 h la mușcăturile a aproximativ 40 de femele P. perniciosus aflate în cușcă, împreună cu cinci masculi pentru a promova comportamentul de mușcătură, cu scopul de a evalua atractivitatea individuală față de vector în aceste condiții experimentale. Câinii au fost clasificați în ordine descrescătoare pe baza numărului de exemplare vii hrănite cu sânge; doi câini care aveau cel mai mic număr de exemplare au fost excluși din studiu, iar doisprezece câini au fost incluși și repartizați în două grupuri de câte șase câini fiecare (grupurile 1 și 2). În ziua 0, câinii din Grupul 2 au fost tratați cu o doză orală de fluralaner (Bravecto® comprimate masticabile) la o doză indicată pe etichetă de 25 până la 56 mg/kg greutate corporală, în timp ce câinii din Grupul 1 au rămas netratați. Observațiile specifice privind starea de sănătate au fost efectuate la 1, 2 și 6 ore după administrarea fluralanerului la ultimul câine. Expunerea câinilor la aproximativ 40-60 de femele de P. perniciosus (plus 5-10 masculi) a fost efectuată în paralel pentru ambele grupuri, în condiții similare de temperatură și umiditate în două încăperi, în zilele 1, 28 și 84 (inițial s-a luat în considerare o evaluare intermediară pentru perioada de aproximativ 50-60 de zile după tratament, deși acest lucru nu a fost posibil din cauza unor probleme tehnice și logistice). Criteriul principal pentru determinarea eficacității a fost rata de supraviețuire a muștelor de nisip hrănite integral cu câini tratați față de cele hrănite integral cu câini de control, nefiind luate în considerare exemplarele hrănite parțial sau marginal cu sânge. Pentru a permite comparații optime și durabile între cele două grupuri de specimene de muște de nisip, femelele au fost recoltate individual din cuștile de expunere prin aspirare blândă pe gură și grupate în grupuri de ≤ 10 specimene în vase de plastic căptușite cu ipsos. Ghivecele au fost apoi plasate în cutii prevăzute cu glucoză saturată și hârtie de filtru umezită și menținute ulterior la 26 °C. Evaluările viabilității au fost efectuate la 6 ore (cu excepția zilei 1) și apoi la intervale de 24 de ore până la maximum 96 de ore după încheierea expunerii. Pentru a evalua viabilitatea generală a lotului de muște de nisip utilizat în fiecare experiment, procedurile descrise mai sus au fost aplicate atât la femelele hrănite, cât și la cele nealimentate.

Semnificația statistică a rezultatelor privind eficacitatea insecticidă, exprimată ca proporție a numărului de muște de nisip vii hrănite din grupul 2 față de cele din grupul 1, a fost calculată cu ajutorul unui model mixt liniar care include grupul de studiu ca efect fix și un bloc de randomizare ca efect aleatoriu, cu un nivel de semnificație stabilit la α = 0,05 (dublu sens). Modelul a utilizat ajustarea Kenward-Rogers pentru a determina gradele de libertate la numitor.

În ziua 1, au fost evaluate 78 de exemplare hrănite cu sânge dintr-un total de 159 de femele vii recoltate de la câinii din Grupul 2, față de 64 de exemplare hrănite cu sânge/169 de femele vii de la câinii din Grupul 1. În ziua 28, specimenele hrănite cu sânge au fost 199/341 de femele vii din Grupul 2, care au fost evaluate față de 146/310 din Grupul 1. În ziua 84, specimenele hrănite cu sânge au fost 240/326 din Grupul 2 și, respectiv, 206/339 din Grupul 1. Tabelul 1 prezintă proporțiile medii de P. perniciosus supraviețuitori după administrarea unei mese de sânge la câinii tratați și netratați. În prima zi de la tratament, au existat dovezi ale unor decese în rândul muștelor de nisip angorjate deja în momentul colectării din cuștile de expunere din Grupul 2, dar nu și din cele din Grupul 1. În 24 de ore, toate exemplarele hrănite cu sânge din Grupul 2 erau moarte, spre deosebire de 11 % din exemplarele hrănite cu sânge din Grupul 1. În ziua 28, supraviețuirea specimenelor hrănite cu câini din Grupul 2 a fost semnificativ mai scăzută decât a celor din Grupul 1 încă de la 6 h după masa de sânge; din nou, toate specimenele hrănite cu sânge din Grupul 2 erau moarte la 24 de ore, spre deosebire de 3 % din specimenele hrănite cu sânge din Grupul 1. În ziua 84, un număr de exemplare care s-au hrănit cu câini tratați au supraviețuit până la sfârșitul observațiilor, cu variații largi în cadrul grupului; rata de supraviețuire a acestora a scăzut începând cu 24 de ore și a fost semnificativ mai mică începând cu 48 de ore în comparație cu exemplarele hrănite cu câini de control, cu o activitate insecticidă calculată de peste 50 % până la 96 de ore de observație.

Ratele de supraviețuire a muștelor de nisip nealimentate, colectate din cuștile de expunere, au fost, de asemenea, evaluate până la 96 h după expunerea fiecărui câine. Acestea au fost în general ridicate și mai mari în comparație cu cele din exemplarele hrănite cu sânge, prezentând unele diferențe între fiecare zi de expunere a unui câine, deși nu atât de mult între grupurile experimentale în fiecare expunere. Acest lucru poate reflecta variațiile de la lot la lot în ceea ce privește mortalitatea care apare de obicei între generațiile de muște de nisip colonizate și, eventual, condițiile diferite de transport. Ingestia de sânge a fost singura variabilă asociată cu o mortalitate de 100% a muștelor de nisip la câinii tratați cu fluralaner (Fig. 1).

Studiul de față, deși nu compară specii diferite de muște de nisip, oferă dovezi suplimentare că sensibilitatea la produsele insecticide canine care vizează sistemul nervos central al muștei de nisip, poate fi mai mare la P. perniciosus decât la P. papatasi. Utilizând aceeași formulă și doze de fluralaner într-un studiu care a inclus Beagles expuși la această specie, Gomez et al. (2018b) au înregistrat o supraviețuire parțială a femelelor P. papatasi hrănite cu sânge (de ordinul a 6-7 %) deja la 17-31 de zile după tratament, care a crescut la aproximativ 25 % în ziua 45.

Există > o perioadă de decalaj de 5 zile pentru ca o muscă de nisip să fie infecțioasă după ce a ingerat o masă de sânge infectată. Prin urmare, există o provocare tehnică pentru studiile cu insecticide sistemice la muștele de nisip în ceea ce privește menținerea unei supraviețuiri ridicate și durabile a specimenelor de control alimentate cu sânge și detectarea oricăror efecte insecticide întârziate care au încă un potențial de blocare a transmiterii. Această provocare este diferită de majoritatea studiilor obișnuite cu tratamente antialimentare, în care muștele de nisip sunt ucise de către operatori imediat după expunerea unui câine și sunt clasificate ca fiind hrănite cu sânge/nealimentate. Sunt necesare evaluări pe termen lung pentru a asigura interpretarea semnificativă și semnificația statistică a diferențelor de supraviețuire între grupurile tratate și cele de control (de exemplu, în timpul concentrațiilor în fază descendentă ale medicamentelor în plasma canină). Utilizarea sângelui canin ex vivo, atât de la câinii tratați, cât și de la câinii de control, în sistemele de hrănire artificială poate fi predispusă la contaminare bacteriană și, prin urmare, poate duce la moartea rapidă a oricăror muște de nisip angorjate, permițând astfel doar o fereastră temporală îngustă pentru a face discriminarea între medicamentele active și cele neactive (Gomez et al., 2018a). În studiul de față, rata de supraviețuire a exemplarelor de control hrănite cu sânge a fost foarte satisfăcătoare, cu un interval de 61-81 % la 96 h după masa de sânge.

Farmacocinetica fluralanerului în plasma canină după o singură administrare orală a arătat o tendință descendentă regulată până la aproximativ 100 de zile după tratament, când devine nedetectabil (Kilp et al., 2014). Este interesant de remarcat faptul că un interval mediu teoretic de aproximativ 40-100 ng fluralaner/mL de plasmă, care corespunde la 84 de zile după tratament, a fost încă capabil să ucidă > 50 % din P. perniciosus în 48 de ore după o masă de sânge. Prin urmare, concentrațiile plasmatice intermediare, cum ar fi cele preconizate între 28 și 84 de zile de la tratament, sunt, de asemenea, susceptibile de a oferi o activitate insecticidă ridicată împotriva vectorului și, prin urmare, sunt necesare noi studii pentru a confirma acest lucru. Pe de altă parte, rezultatele prezentului studiu în ceea ce privește cele trei momente de timp arată în mod clar o tendință coerentă de reducere a eficacității pe tot parcursul studiului.

În concluzie, tratamentul cu fluralaner al câinilor reprezintă o metodă promițătoare pentru reducerea rezervei de vectori infectați în mediile endemice de VL zoonotică. În plus, utilizarea fluralanerului în combinație cu tratamente preventive topice cu piretroizi, cu condiția ca acest lucru să nu fie contraindicat pentru siguranța câinelui (Walther et al., 2014), ar putea aduce beneficii pentru câinii din zonele cu risc ridicat.