Sinonime

Acizi grași neesterificați (NEFA), acizi grași liberi, acizi grași nesaturați

Fiziologie

Acizii grași neesterificați („liberi” sau nesaturați) (NEFA) sunt componenta principală a trigliceridelor (depozitele de grăsime din organism), care constau din trei acizi grași legați de o coloană vertebrală de glicerol. La animalele sănătoase (atunci când mănâncă sau nu se află în stări de deficit energetic), NEFA provin în principal din descompunerea trigliceridelor ingerate în alimentație prin intermediul chilomicronilor (lipaza lipoproteică eliberează NEFA din resturile de chilomicroni). Cu toate acestea, în condiții de post sau în stări de bilanț energetic negativ, principala sursă de NEFA este hidroliza depozitelor de grăsime din organism.

Hidroliza trigliceridelor stocate (grăsimi) în țesutul adipos de către lipaza sensibilă la hormoni eliberează NEFA și glicerol. Lipaza sensibilă la hormoni (care se găsește în citosolul adipocitelor) este stimulată de diverși hormoni, inclusiv de glucagon (care este eliberat de celulele α din insulele pancreatice ca răspuns la un nivel scăzut de glucoză) și de corticosteroizi. Odată eliberați din grăsimi sau chilomironi, NEFAs pot fi utilizați ca sursă de energie de multe țesuturi, inclusiv de mușchii scheletici și hepatocite. În hepatocite, soarta lor diferă în funcție de nevoile energetice, de echilibrul hormonal și de disponibilitatea substratului, adică pot fi utilizate pentru producerea de energie (prin ciclul Kreb), reambalate în trigliceride și exportate sub formă de lipoproteine cu densitate foarte scăzută (VLDL) sau stocate în ficat sub formă de trigliceride (care, în exces, pot provoca lipoidoză hepatică) sau transformate în cetone.

Metodologie

Metoda primară pentru măsurarea concentrației de NEFAs în ser este o metodă enzimatică colorimetrică, care este metoda utilizată la Universitatea Cornell.

Tip de reacție

Reacție cu punct final înfundat. Blanking diminuează efectul hemolizei asupra concentrațiilor de NEFA.

Procedură utilizată la Universitatea Cornell

În prima etapă a acestei reacții în trei etape, acil-CoA sintetaza (ACS) catalizează acilarea NEFA-urilor cu (coenzima A) CoA, ceea ce duce la formarea de acil-CoA. Peroxidul de hidrogen este apoi generat din oxidarea acil-CoA prin acțiunea catalitică a acil-CoA oxidazei (ACOD). În cele din urmă, peroxidul de hidrogen în prezența peroxidazei (POD) permite condensarea oxidativă a 4-aminoantipirinei cu 3-metil-N-etil-N-(β-hidroxietil)-anilina (MEHA) pentru a forma un produs final albastru-violet cu un maxim de absorbție la 550 nm. Concentrația de NEFA este direct proporțională cu densitatea optică măsurată a produsului colorant.

Reacțiile sunt prezentate mai jos:

NEFA+ ATP + CoA acil-CoA sintetază > Acil-CoA + AMP + pirofosfat

Acil-CoA + O2 + acil-CoA oxidază > 2,3-trans-Enoil-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirină + MEHA peroxidază > complex albastru-violet+ 3H2O

Unități de măsură

Concentrația de NEFAs se măsoară în mEq/L (unități convenționale) sau mmol/L (unități SI). Conversia unităților se obține din următoarea formulă:

mEq/L x 1= mmol/L

Considerații privind probele

Tipul de probă

Serum sau plasmă EDTA. Serul/plasma trebuie separate de celule cât mai curând posibil după recoltare, iar serul/plasma trebuie să fie plasate într-un tub separat. În mod similar, nu se recomandă utilizarea tuburilor corvac (sero-separator), deoarece valorile sunt ușor (dar semnificativ) mai mari în aceste tuburi în comparație cu tuburile neanticoagulante (red top).

Anticoagulant

EDTA. Valorile sunt mai puțin stabile în heparină, care, de asemenea, produce concentrații inițiale mai mari decât EDTA sau serul, iar valorile NEFA cresc odată cu depozitarea (Stokol și Nydam 2005).

Stabilitate

Stabil în ser bovin sau în plasmă EDTA la 4°C timp de 72 de ore. Stabil la congelare în ser de bovine timp de 1 lună (-70°C). Valorile au crescut în 24-48 de ore de la depozitarea la 24°C în ser sau plasmă EDTA. Concentrațiile de NEFA cresc rapid în heparină după depozitare. (Stokol și Nydam 2005).

Recomandări pentru colectarea probelor la vacile de lapte în tranziție

• Anticoagulant: Red top (ser) sau purple top (EDTA). Evitați tuburile cu heparină (vârf verde) și corvac (separator de ser).
• Manipulare: Separați de celule cât mai curând posibil, păstrați la rece pentru a minimiza falsele modificări ale rezultatelor (NEFAs sunt deosebit de instabile), trimiteți cât mai curând posibil la laborator.
• Momentul recoltării: Prelevați probe de la vaci în momentul în care acestea intră în boxele de hrănire (a se vedea mai jos).
  • NEFAs prepartum: Colectați probe de la vaci cu 2-14 zile înainte de fătare.
  • NEFA postpartum: Colectați probe de la vaci cu 3-14 zile în lapte. Măsurarea atât a NEFA postpartum, cât și a BHB se efectuează în cadrul unui profil energetic al vacilor de tranziție pentru evaluarea stării energetice la vacile care alăptează la Laboratorul de patologie clinică din cadrul Universității Cornell.
• Număr de vaci: Pentru testarea la nivel de efectiv trebuie prelevate cel puțin 12 animale pe turmă (descrierea testului în secțiunea de interpretare a testului de mai jos). Acesta poate fi un amestec de juninci și vaci cu >2 parități.
• Eșantioane grupate: NU se recomandă punerea în comun a probelor individuale de la vaci pentru a evalua starea energetică a unei turme. Studiile de la Universitatea Cornell au arătat că rezultatele din probele grupate sunt mai puțin sensibile decât testarea individuală a vacilor (minimum 12 animale pe turmă) atunci când se utilizează NEFA pregătitor sau postpartum pentru detectarea bilanțului energetic negativ excesiv la vacile de lapte în tranziție.

Interferențe

• Lipemie, icter: Efect necunoscut (rar la bovine).
• Hemoliză: În funcție de metoda utilizată de laborator, hemoliza va scădea sau va crește valorile NEFA. În metoda cu albire utilizată la Universitatea Cornell, hemoliza severă (indice hemolitic > 800 unități) va scădea ușor concentrațiile de NEFA în sângele bovin. Interferenții lipemici și icterici nu afectează substanțial concentrația NEFAs cu metodele utilizate de Universitatea Cornell.
• Excitare/exercițiu/stres: Aceste condiții, care induc eliberarea de catecolamine sau ACTH, cresc concentrațiile de NEFA prin stimularea lipolizei prin intermediul lipazei sensibile la hormoni. Aceste condiții trebuie reduse la minimum atunci când se recoltează probe de sânge pentru măsurarea NEFA.
• Momentul recoltării probelor: Valorile NEFA sunt susceptibile de a fi mai mari la vacile care vin pentru hrănirea zilnică (susceptibile de a fi într-un anumit grad de echilibru energetic negativ) față de acele vaci care tocmai au fost hrănite (lipoliza va fi inhibată la aceste din urmă vaci). Se recomandă colectarea chiar înainte de hrănire.

Interpretarea testului

Testarea NEFA se face mai ales la bovinele de lapte pentru a determina dacă efectivul se află într-un echilibru energetic negativ excesiv. Este utilizat mai mult ca un test la nivelul turmei decât la nivelul fiecărui animal în parte, iar rezultatele sunt interpretate în funcție de o concentrație limită sau de procentul de animale cu valori peste limita limită față de valorile peste limita superioară de referință. Măsurarea NEFA poate fi efectuată la orice altă specie ca marker al unui echilibru energetic negativ excesiv. Acest lucru se face cel mai frecvent la camelide (care dezvoltă lipidoză hepatică în aceste circumstanțe), la alte rumegătoare (de exemplu, capre, oi) pentru a determina dacă sunt expuse riscului de cetoză și la cai (cu sindrom metabolic ecvestru). Rețineți că concentrațiile sub limita de referință nu sunt relevante din punct de vedere clinic.

Concentrații crescute

• Fiziologic: Exercițiul fizic induce eliberarea de catecolamine și ACTH, care stimulează activitatea hidrolitică a lipazei sensibile la hormoni pentru a promova mobilizarea grăsimilor pentru a satisface necesarul de energie în exces. Acest proces crește concentrația de NEFAs în sânge.
• Diferențe între rase: Mai multe studii au arătat că NEFAs sunt mai mici la vacile Jersey postpartum decât la vacile Holstein, prin urmare, este posibil ca liniile directoare elaborate pentru vacile Holstein (a se vedea mai jos) să nu fie aplicabile la Jerseys (Rastani et al 2001, French 2006, Guretsky et al 2006, Brown et al 2012).
• Bilanț energetic negativ la vacile de lapte: Vacile de lapte în perioada periparturientă (de tranziție) se află întotdeauna într-o stare de bilanț energetic negativ din cauza cererii mari de energie din partea fătului în dezvoltare și a producției de lapte (în special cu accentul pus pe selecția pentru producătorii mari de lapte). Cu toate acestea, această stare de balanță energetică negativă poate fi excesivă, iar vacile afectate sunt expuse riscului de boli gastrointestinale (abomasum deplasat), metabolice (cetoză clinică) și infecțioase (de exemplu, metrită) în perioada postpartum timpurie. Prin urmare, practicienii din domeniul produselor lactate monitorizează frecvent efectivele de vaci de lapte pentru a detecta un echilibru energetic negativ excesiv prin testarea NEFA, fie numai la vacile pre sau postpartum, fie ca o componentă a unui profil metabolic la vacile postpartum. Rezultatele acestor teste pot fi interpretate la nivelul fiecărei vaci în parte (de exemplu, o valoare NEFA peste un anumit prag indică un echilibru energetic negativ excesiv) sau la nivelul turmei (de exemplu, o proporție de vaci testate au valori NEFA peste un anumit prag). Identificarea unui bilanț energetic negativ în exces la vacile individuale (și, mai important, la efectivul de vaci) indică necesitatea de a modifica alimentația (de exemplu, creșterea spațiului de hrănire la buncăr, creșterea densității energetice a rației) și gestionarea vacilor de tranziție pentru a reduce cererea de energie și stresul asupra vacilor de tranziție. Următoarele orientări de interpretare se bazează pe studii efectuate la Universitatea Cornell și sunt valabile pentru eșantioanele recoltate de la vaci Holstein hrănite cu TMR „la risc” între 2-14 zile înainte de fătare (NEFAs prepartum) sau 3-14 zile după fătare (NEFAs postpartum). Recomandăm prelevarea de probe de la cel puțin 12 vaci „la risc” atunci când se evaluează efectivele hrănite cu rație mixtă totală (TMR) pentru cetoza subclinică (Ospina et al. 2013).
  • Testarea la nivelul vacilor
    • Prepartum NEFAs: Există o incidență crescută a afecțiunilor postdecolmatare (abomasum deplasat, metrită/placenta reținută și cetoză clinică), scăderea producției de lapte și scăderea performanțelor de reproducere în primele 30 de zile în lapte la vacile de lapte Holstein (hrănite cu TMR) cu valori NEFA > 0,30 mEq/L atunci când sunt testate cu 2-14 zile înainte de fătare.
    • NEFAs postpartum: Există o incidență crescută a afecțiunilor postdecolmatare (abomasum deplasat, metrită/placenta reținută și cetoză clinică), scăderea producției de lapte și scăderea performanțelor de reproducere în primele 30 de zile în lapte la vacile de lapte Holstein (hrănite cu TMR) cu valori NEFA > 0,60-0,70 mEq/L atunci când sunt testate la 3-14 zile după fătare. În cadrul studiilor Cornell, NEFAs după fătare au fost, de fapt, un predictor mai bun decât concentrațiile de β-hidroxibutirat după fătare sau NEFAs înainte de fătare.
  • Testarea la nivel de efectiv
    • NeFAs înainte de fătare: La nivelul cirezii, există un risc semnificativ crescut de boli metabolice și infecțioase după fătare, de scădere a producției de lapte sau de scădere a performanțelor de reproducere dacă >15% din vacile testate înainte de fătare au valori NEFA > 0,30 mEq/L. Rețineți că, așa cum s-a indicat mai sus, nu se recomandă gruparea probelor de la vaci individuale pentru testarea la nivelul turmei.
    • NEFA postpartum: La nivelul turmei, există un risc semnificativ crescut de boli metabolice și infecțioase postpartum, de scădere a producției de lapte sau de scădere a performanțelor de reproducere dacă >15-20% dintre vacile testate postpartum au valori NEFA > 0,70 mEq/L. Rețineți că, așa cum s-a indicat mai sus, nu se recomandă gruparea probelor de la vaci individuale pentru testarea la nivelul turmei.
• Lipidoza hepatică la bovinele de lapte: Într-un studiu, un raport NEFA:colesterol >0,2 (unități SI) a avut un raport de șanse de 9,9 ca un animal să aibă lipidoză hepatică (definită ca >10% conținut de lipide în ficat), acest cut-off fiind mai sensibil (63% cu o specificitate de 85%) decât BHB, NEFA singur sau activitatea AST (>120 U/L) pentru diagnosticarea lipidozei hepatice (pe baza ariei de sub curba caracteristică de funcționare a receptorului sau AUC). Cu toate acestea, la animalele din acest studiu s-au efectuat măsurători de sânge la diferite momente după lactație (Mostafavi et al 2013).
• Echilibru energetic negativ la animalele mici: Aceasta apare în principal în cazul diabetului zaharat. Într-o stare de deficiență de insulină sau de rezistență la insulină se pierde inhibiția lipazei sensibile la hormoni. Un dezechilibru de reglare a activității lipazei hormonosensibile crește mobilizarea grăsimilor din țesutul adipos în țesutul hepatic, crescând concentrația de NEFAs.
• Echilibru energetic negativ la camelide: Camelidele bolnave, stresate, în special femelele gestante, sunt expuse riscului de a dezvolta lipidoză hepatică. Măsurarea NEFA se poate face pentru a determina dacă acestea se află în echilibru energetic negativ. Cămilele cu NEFA > 0,8 mEq/L (Tornquist et al 2001) prezintă un risc crescut de lipidoză. Cămilele anorexice au frecvent NEFA care sunt crescute, dar sub această valoare și este posibil ca acestea să nu dezvolte lipidoză.