Oligoanele Morpholino sunt instrumente avansate pentru blocarea unor situsuri pe ARN pentru a obstrucționa procesele celulare. Un oligo Morpholino se leagă în mod specific de situsul său țintă selectat pentru a bloca accesul componentelor celulare la acel situs țintă. Această proprietate poate fi exploatată pentru a bloca traducerea, pentru a bloca splicingul, pentru a bloca miARN-urile sau țintele lor și pentru a bloca activitatea ribozomilor.
Blocarea traducerii: Prin blocarea sterică a complexului de inițiere a traducerii, Morpholinos poate anula expresia multor secvențe țintă suficient de complet încât, după ce se așteaptă ca proteina existentă să se degradeze, banda proteinei țintă să dispară de pe Western blots. Spre deosebire de multe tipuri de antisens (de exemplu, siARN, fosforotionați), Morpholinos nu provoacă, în general, degradarea ARN-ului țintă; în schimb, blochează activitatea biologică a ARN-ului țintă până când ARN-ul respectiv este degradat în mod natural, ceea ce eliberează Morpholino. Acest lucru înseamnă că RT-PCR nu este adecvată pentru evaluarea blocării traducerii de către Morpholinos.
Splice Blocking: Prin blocarea situsurilor implicate în splicingul pre-ARNm, Morpholinos poate fi folosit pentru a modifica și controla evenimentele normale de splicing. Această activitate poate fi testată în mod convenabil prin RT-PCR, modificarea cu succes a îmbinării apărând ca modificări ale benzii produsului RT-PCR pe un gel electroforetic. Banda ar putea să se deplaseze către o nouă masă sau, în cazul în care modificarea îmbinării declanșează o descompunere a transcrisului mediată de nonsens, banda îmbinată sălbatic își va pierde din intensitate sau va dispărea.
Ca toți reactivii de eliminare a genelor, Morpholinos trebuie să fie livrați în mod activ în majoritatea celulelor. Morpholinos poate fi livrat în celulele cultivate printr-o varietate de metode, inclusiv prin încărcarea prin răzuire a celulelor aderente, electroporare și chiar microinjectare. Cu toate acestea, reactivul nostru de livrare Endo-Porter oferă, în general, o livrare excelentă în celulele cultivate în ceea ce privește cantitatea de Morpholino livrată per celulă, distribuția uniformă în cadrul unei populații de celule, reproductibilitatea livrării și non-toxicitatea pentru majoritatea tipurilor de celule la concentrația recomandată. Pentru experimentele pe animale, Vivo-Morpholino-urile noastre, cu fracțiunea de livrare atașată, pătrund în celule din sânge după administrarea i.v. sau pătrund în celulele din țesuturile care înconjoară injecțiile locale; acestea sunt, de asemenea, cele mai convenabile oligo antisens pentru utilizarea în culturi de celule sau explante, deoarece nu necesită niciun agent suplimentar pentru livrarea citosolică.

Un oligo Morpholino este radical diferit de acizii nucleici naturali, cu inelele de metilenemorfolină care înlocuiesc părțile de zahăr din riboză sau deoxiriboză și legăturile fosfodiamidate neionice care înlocuiesc fosfații anionici din ADN și ARN. Fiecare inel de morfolină poziționează în mod corespunzător una dintre bazele standard ale ADN (A, C, G, T) pentru împerechere, astfel încât un oligo Morpholino de 25 de baze se leagă puternic și specific de situsul său țintă complementar de 25 de baze dintr-un șir de ARN prin împerechere Watson-Crick. Deoarece coloana vertebrală neîncărcată a oligo Morpholino nu este recunoscută de enzime, aceasta este complet stabilă față de nucleaze.
Vă încurajăm să aduceți un instrument mai precis și mai puternic pentru a face față provocărilor dumneavoastră experimentale. Sunați grupul nostru de asistență pentru clienți la nivel de doctorat de la Gene Tools pentru a începe să folosiți Morpholinos în studiile dumneavoastră. Telefon: (541) 929-7840, interior 1.

1. Evaluarea livrării

Ca în cazul tuturor agenților de eliminare a genelor, livrarea eficientă a Morpholinos este crucială. În timp ce confirmarea livrării nu este crucială pentru experimentele care utilizează microinjecția embrionară, confirmarea livrării este importantă pentru experimentele cu celule cultivate. Reactivul nostru de livrare Endo-Porter oferă, în general, o livrare simplă și fiabilă pentru majoritatea tipurilor de celule. Puteți evalua dacă obțineți o livrare bună în citosolul celulelor dvs. prin utilizarea unui Morpholino marcat fluorescent. Vă recomandăm să folosiți în acest scop oligo-ul nostru ieftin de control standard marcat cu fluoresceină.
Când folosiți un Morpholino fluorescent pentru a confirma livrarea, începeți cu o concentrație de 10 microMolari de oligo Morpholino în mediul de cultură. Aceasta este o concentrație suficient de mare pentru ca, după 16 ore, Morpholino marcat fluorescent să fie vizibil în citosol prin microscopie cu fluorescență. Un microscop fluorescent inversat este cea mai bună alegere pentru observarea celulelor în plăci de cultură. Observați celulele vii (nefixate). Folosiți un obiectiv uscat cu cea mai mare deschidere numerică disponibilă pentru a colecta cât mai multă lumină din celule. Livrarea reușită se manifestă prin fluorescență difuză în tot citosolul. Fluorescența punctată indică, de obicei, faptul că oligo este prins în endosomi, așa că ignorați petele punctate și căutați fluorescența difuză.
Pentru experimentele efective de livrare a secvenței dvs. personalizate de Morpholino cu Endo-Porter aveți nevoie, în general, de o concentrație de numai 1 până la 5 microMolari pentru blocarea sterică eficientă a majorității ARNm.

2. Solubilitate și Morpholinos

Deși oligo Morpholino sunt mult mai solubile decât alte tipuri structurale non-ionice (cum ar fi PNA), unele Morpholinos cu un conținut ridicat de G (>30%) au o solubilitate limitată. De asemenea, atașarea fluorului nostru de lissamină care emite roșu scade uneori solubilitatea oligo. Solubilitatea variază în funcție de secvența oligo și este dificil de prezis. Recomandările de mai jos pot ajuta la menținerea activității oligo în cazul în care secvența dvs. are o solubilitate slabă.
Pentru depozitarea pe termen lung, soluțiile dvs. stoc Morpholino sunt cel mai bine depozitate liofilizate, Următoarea cea mai bună alegere este depozitarea în soluție la temperatura camerei. Realizarea soluțiilor stoc Morpholino la sau sub 1 miliMolar ajută la evitarea problemelor de solubilitate. Ciclurile de îngheț-dezgheț sau depozitarea pe termen lung la 4C pot provoca precipitarea sau asocierea în recipient a Morfolino și pot scădea activitatea soluției; recomandăm depozitarea la temperatura camerei în recipiente bine închise și, pentru a evita evaporarea în cazul unui sigiliu defectuos al flaconului, este prudent să se depoziteze stocurile într-un mediu umed, cum ar fi un umidor (de exemplu, un borcan cu clopot cu un pahar de apă deschis). Aveți grijă ca oligozaurul să nu se usuce, deoarece poate fi dificil sau imposibil să se dizolve din nou un oligozaur uscat (deși oligozaurul liofilizat se dizolvă destul de ușor). Păstrarea flaconului într-o cutie întunecată sau învelită în folie de aluminiu este o bună practică, deoarece oligoelementele marcate cu fluor se pot fotobelifica la lumină.
Agregarea în soluție poate cauza o scădere a activității biologice în timp și acest lucru poate apărea în soluțiile păstrate la temperatura camerei. Acest lucru poate fi inversat în unele cazuri prin încălzire timp de 5 min la 65C sau, în majoritatea cazurilor, prin autoclavare (utilizați ciclul lichid). Oligoelementele sunt foarte stabile la căldură și pot tolera mai multe cicluri de autoclavare fără a se degrada. Adesea, autoclavarea va revigora un stoc care și-a pierdut o parte din activitate din cauza agregării oligo.
ADN-ul, ARN-ul și majoritatea reactivilor de knockdown genic se depozitează de obicei într-o baie de gheață în timpul experimentelor pentru a minimiza degradarea de către nucleaze. Deoarece Morpholinos sunt complet rezistente la degradarea enzimatică și soluțiile apoase sunt stabile din punct de vedere chimic pe termen nelimitat (ani) la temperatura camerei, vă recomandăm ca în timpul experimentelor să păstrați soluțiile stoc de Morpholinos la temperatura camerei. Răcirea soluțiilor stoc într-o baie de gheață riscă pur și simplu să provoace precipitarea Morpholino.
Aceste precauții sunt mai mult decât necesare pentru majoritatea secvențelor, dar utilizarea lor de rutină vă ajută să evitați surprizele neplăcute în cazul în care întâlniți o secvență cu solubilitate scăzută.

.