Am folosit surse nutritive de glucoză, glucoză și glutamină pentru a descifra fluxul de carbon în celulele K562 și modificările ca răspuns la tratamentul cu BaP. În general, observăm cea mai mare cantitate de încorporare a etichetei în fracțiuni de riboză și lactat (a se vedea și Fișierul suplimentar 1: Figura S1 pentru detalii privind distribuția etichetelor). După cum se ilustrează în figura 1, se poate aștepta ca încorporarea etichetei în ciclul Krebs care provine din glucoză să producă două modele de etichetare distinct diferite ale metaboliților din ciclul Krebs, în funcție de faptul dacă fragmentul C2 intră prin piruvat carboxilaza (PC) sau piruvat dehidrogenază (PDH). Piruvatul format din glucoză va produce glutamat prin intermediul PDH, dar glutamatul prin activitatea PC. Deoarece activitatea PC produce oxaloacetat din piruvat, se așteaptă ca malatul să fie derivat din PC, în timp ce produsul PDH va fi malat sau malat.

Spectrele RMN indică faptul că cantități mari de aspartat și malat sunt derivate din PC

Cum se arată în Fig. 2, se observă diferențe semnificative între celulele care prelucrează glucoza timp de 3 vs. 24 h pentru rezonanțele de malat și aspartat. Aceste diferențe se manifestă predominant printr-o modificare a constantelor de cuplare RMN. Mărimea acestor constante de cuplaj depinde de natura atomului de carbon adiacent: o grupare de acid carboxilic produce o constantă de cuplaj mult mai mare decât o grupare CH2. Constanta de cuplaj pentru fracțiunea 13C1 13C2 din aspartat sau malat este de aproximativ 50-60 Hz, în timp ce constanta de cuplaj pentru o fracțiune 13C2 13C3 este de aproximativ 35-40 Hz.

Pentru o perioadă de etichetare de 24 de ore, Fig. 2 arată constante aparente de cuplaj de 53 Hz pentru C2 de malat și aspartat. Această constantă de cuplaj aparentă mare arată că predomină cuplajul lui C2 cu grupul de acid carboxilic C1 adiacent. Acest model de cuplaj 13C1 13C2 (și, de asemenea, 13C3 13C4, a se vedea Fișierul suplimentar 1) provine din activitatea PDH și, posibil, și din metaboliții care trec de mai multe ori prin ciclul Krebs pentru o perioadă de etichetare mai lungă.

Pentru scurta perioadă de etichetare de 3 ore, se observă constante de cuplaj aparente mai mici de 47 și 41 Hz pentru C2 (Fig. 2 și Fișierul suplimentar 1: Figura S1), ceea ce indică faptul că predomină cuplajul cu metilenul C3 adiacent. Prezența fracțiunii 13C2 13C3 la perioade de etichetare mai scurte arată că produsul care rezultă din activitatea PC domină pentru perioade de etichetare mai scurte.

Trebuie remarcat faptul că diviziunile de semnal observate nu reprezintă constantele de cuplaj scalar precise într-un amestec de compuși marcați. Cu toate acestea, modificarea observată oferă o indicație clară a unor cantități mai mari de produs PC la perioade de marcare mai scurte, atât în cazul malatului, cât și al aspartatului.

Dovadă suplimentară pentru activitatea PC în subspectrele uracilului

În sinteza de novo a pirimidinei, uracilul se formează din aspartat prin carbamoil-aspartat, orotat și dihidroorotat. Prin urmare, modelele de marcare în aspartat ar trebui să se reflecte în semnalele inelului pirimidinic. Fișierul suplimentar 2: Figura S2 prezintă încorporările de etichete preconizate pentru uracil. Atunci când baza uracil din UDP este sintetizată din aspartat, destinația 13C-urilor este următoarea: C1, C2 și C3 din aspartat devin, respectiv, C10, C11 și C12 din UDP, în timp ce C4 se pierde (a se vedea fișierul suplimentar 2). În spectrele HSQC, doar C11 și C12 pot fi observate direct, deoarece C10 nu are un proton atașat.

Pentru probele marcate cu glucoză, aspartatul derivat din PC va fi marcat cu C2C3. Acesta este transformat într-un fragment C11C12 marcat în UDP. Cu toate acestea, aspartatul derivat din PDH poate fi marcat la C1C2 sau C3C4. Acest lucru se traduce în C10C11 sau, respectiv, într-un C12 izolat în uracil. Prin urmare, spectrele de C12 sunt indicative pentru cantitățile relative de activitate PC vs. PDH; PC produce un dublet pentru C12, în timp ce PDH produce un singlet la C12.

Toate spectrele au prezentat atât semnalul singlet, cât și semnalul dublet la C12 (Fig. 3). Cu toate acestea, intensitatea dubletului în raport cu cea a singletului s-a modificat între datele de 3 și 24 h de un factor de trei, indicând din nou o trecere de la marcarea mediată de PC la PDH cu timpul. Imaginea care se desprinde din mai mulți metaboliți este că există o activitate paralelă atât a PC, cât și a PDH, dar produsul PC este canalizat în primul rând în produse direct legate de oxaloacetat, ceea ce generează cantitatea mare observată de produs PC în acești metaboliți în cazul unei expuneri pe termen scurt. Numai la perioade mai lungi de etichetare se observă produsul PDH în ramura stângă a ciclului Krebs.

BaP-indusă de malonat este derivată din activitatea PC din aval în celulele K562

Am arătat că malonatul poate fi format din oxaloacetat prin conversie chimică sub influența peroxidului de hidrogen și am sugerat în studiul nostru anterior că acumularea de malonat ca răspuns la tratamentul cu BaP a fost determinată de creșterea indusă de tratament a ROS care acționează asupra oxaloacetatului . Probele au fost îmbogățite cu malonat pentru a confirma atribuirea noastră a rezonanțelor 1H/13C ale metilenului de malonat în spectrele HSQC (a se vedea fișierele suplimentare 3 și 4). Ulterior, în acest studiu, abordarea noastră bazată pe trasor ne-a permis să luăm în considerare originile malonatului observat.

După cum se arată în Fig. 4a, malonatul derivat din ROS care provine din oxaloacetat care a fost format direct din piruvat prin activitatea PC folosind glucoza ca sursă de nutrienți ar trebui să fie marcat în pozițiile C1 și C2. În situația alternativă în care activitatea PDH convertește piruvatul în acetil-coA la intrarea în ciclul Krebs, conversia mediată de ROS a oxaloacetatului rezultat în malonat ar trebui să dea naștere la doi produși cu marcaj în poziția C1 sau în pozițiile C1 și C2 într-un raport 1:1, deoarece ciclul Krebs trece prin succinat și fumarat simetric (a se vedea și Fig. 1).

Figura 4b arată o felie 1D reprezentativă din spectrele HSQC provenite din celule marcate cu glucoză tratate cu BaP timp de 24 h și demonstrează clar generarea indusă de medicament a unui semnal puternic de malonat. În spectrele HSQC corespunzătoare provenite de la celulele marcate cu glucoză tratate cu BaP timp de 24 h, am observat un dublet clar (Fig. 4c prezentată ca vârfuri roșii) cu o divizare de 58 Hz, care indică o grupare CH2 marcată cuplată la un carbon de acid carboxilic. Aceasta este o indicație clară a unui malonat marcat C1,C2 (sau C2,C3) cu marcaj în doar una dintre cele două grupe de acid carboxilic. Malonatul marcat în toate cele trei poziții care ar putea rezulta din trecerile multiple prin ciclul Krebs ar trebui să prezinte un triplet la C2 în dimensiunea 13C a spectrelor HSQC, deoarece cel puțin un anumit procent ar fi marcat în ambele grupe COO (model de cuplare AX2). Prin urmare, absența unui semnal central în HSQC indică faptul că malonatul este derivat din activitatea PC din amonte. Absența malonatului derivat din mai multe cicluri Krebs și din activitatea PDH este, de asemenea, susținută de faptul că malonatul rezultat în urma marcării timp de 24 de ore a celulelor tratate cu BaP cu glucoză a prezentat doar un singlet (Fig. 4c prezentat ca vârf albastru).

Pentru a dovedi în continuare că malonatul indus de medicament este derivat în aval de activitatea PC, am achiziționat spectre 13C-1D în care am putut observa direct rezonanțele COO ale malonatului (Fig. 4d). Un spectru de referință al acidului malonic 10 mM în același tampon (pH 7) ca și cel utilizat pentru extractele celulare a confirmat frecvența rezonanței COO (Fig. 4d).

Se așteaptă ca marcarea mediată de PC să producă un dublet la C1 (care provine din malonat), în timp ce marcarea mediată de PDH ar trebui să producă un amestec 50:50 de un dublet care provine din malonat și un singlet care provine din malonat (Fig. 4a). Deși zgomotos chiar și după 24 de ore de achiziție, spectrele derivate au arătat un dublet clar, fără semnal rezidual în mijloc (Fig. 4d), confirmând că produsul de marcare derivat din PC este dominant. De aici, concluzionăm că malonatul este într-adevăr derivat din conversia oxaloacetatului mediată de ROS care provine în întregime sau cel puțin predominant din activitatea PC și nu prezintă nicio contribuție din partea unui posibil produs PDH chiar și după o perioadă de marcare de 24 de ore. Experimentele de control care utilizează glutamina ca sursă de carbon au arătat doar o încorporare minimă a marcajului în malonat. S-a demonstrat că malonatul produs din glucoză este marcat predominant prin intermediul PC. Împreună, aceste două fapte sugerează cu tărie că malonatul este produs predominant din glucoză prin glicoliză și intrarea piruvatului în ciclul TCA mediată de PC.

Evidențe ale activității PDH paralele

Tabelul 1 compară constantele de cuplaj 1 J CC și modelele de intensitate a multipleților observate în seturile de date marcate timp de 3 și 24 h. În ambele seturi de date de 3 și 24 h, marcarea la C4 a glutamatului este mult mai mare decât marcarea la C4, iar divizarea observată la C4 indică un cuplaj la C5. Acest lucru sugerează cu tărie că marcarea mediată de PDH este dominantă pentru glutamat în ambele momente de timp. Citratul C2 este divizat de un cuplaj mare la C1, sugerând din nou cu tărie că etichetarea mediată de PDH este dominantă. Aceste modele de etichetare indică o dominanță clară a produselor PDH pentru ramura dreaptă a ciclului Krebs, care duce de la citrat la glutamat.

Analiză computațională a multipleților

Tăieturi din 1H-13C-HSQC au fost, de asemenea, analizate cantitativ prin simularea spectrelor 13C-NMR pentru un amestec de izotopomeri diferiți folosind software-ul pyGamma din cadrul software-ului NMRLab . Pentru glutamat, analiza multipletului a confirmat că marcarea mediată de PDH a fost dominantă atât la 3 cât și la 24 de ore, indiferent de tratamentul cu BaP. Pentru aspartat, analiza multipleților a confirmat că a existat o trecere de la marcarea mediată de PC la 3 h la marcarea mediată de PDH la 24 h. Spectrele simulate sunt prezentate în Fișierul suplimentar 5: Figura S4, iar Tabelul 2 confirmă rezultatele calitative pentru aspartat și glutamat.

.