În 1440, preotul, umanistul, retoricul și oratorul italian Lorenzo Valla a pus în circulație în manuscris De falso credita et ementita Constantini Donatione declamatio, demonstrând pe baze istorice și lingvistice că Donația lui Constantin este un fals. Din cauza opoziției bisericii, eseul nu a fost publicat în mod oficial pe hârtie decât în ediția lui Ulrich von Hutten din 1517. A devenit popular printre protestanți, iar o traducere în limba engleză a fost publicată pentru Thomas Cromwell în 1534. Valla și-a argumentat cazul atât de convingător încât acesta rămâne valabil și astăzi, iar nelegitimitatea Donației lui Constantin este în general recunoscută.

Valla a arătat că documentul nu ar fi putut fi scris în epoca istorică a lui Constantin I (secolul al IV-lea) deoarece stilul său vernacular datează în mod concludent dintr-o epocă ulterioară (secolul al VIII-lea). Unul dintre motivele lui Valla a fost faptul că documentul conținea cuvântul satrap, pe care el credea că romani precum Constantin I nu l-ar fi folosit.

Deși inițial a fost întâmpinată cu mari critici, Donația lui Constantin a fost acceptată ca fiind legitimă, în special datorită naturii benefice a conținutului său pentru biserica occidentală. Donația lui Constantin sugera că Constantin I a „donat” întregul Imperiu Roman de Vest Bisericii Romano-Catolice ca un act de recunoștință pentru că fusese vindecat în mod miraculos de lepră de către papa Silvestru I. În mod evident, acest lucru ar fi desconsiderat propria Donație a lui Pepin cel Scurt, care le dădea longobarzilor pământuri la nord de Roma.

„Valla a fost motivat să dezvăluie Donația lui Constantin ca fiind o fraudă de către angajatorul său din acea vreme, Alfonso de Aragon, care era implicat într-un conflict teritorial cu statele papale, pe atunci sub conducerea papei Eugen al IV-lea. Donația lui Constantin fusese adesea citată pentru a susține puterea temporală a papalității, cel puțin din secolul al XI-lea” (articolul Wikipedia despre Lorenzo Valla, accesat la 17.01.2009).

.