2.2 Strategii de producere a Levanului

Levanul este sintetizat ca exopolizaharidă (EPS) în matricea extracelulară a bacteriilor din diverse genuri, cum ar fi Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus și Zymomonas (Sarilmiser et al., 2015). În plus față de acești producători de levanți extremofili, Poli et al. (2009) au raportat Halomonas sp. ca producător de levanți. Au fost investigate în continuare studii privind utilizarea potențială a Halomonas levan ca agent de bioflocalizare (Sam et al., 2011), sistem de eliberare a medicamentelor pe bază de peptide și proteine (Sezer et al., 2011, 2015), subțire biocompatibil (Sima et al., 2011, 2014), film multistrat adeziv (Costa et al., 2013) și un glican care imită heparina (Erginer et al., 2016). Fig. 12.2 prezintă procesul general de producție a levanților microbieni.

Figura 12.2. Etapele de bază ale prelucrării în aval pentru levan.

EPS-urile microbiene sunt produse, de obicei, în sisteme de fermentare aerobe, submerse. Condițiile de fermentare, cum ar fi aerarea, agitația, pH-ul, concentrația de oxigen dizolvat, temperatura, compoziția mediului și designul bioreactorului pot determina caracteristicile produsului și randamentul de producție. Prin urmare, pentru a obține o calitate și un randament ridicat al producției, trebuie să se realizeze o optimizare elaborată a acestor parametri pentru fiecare organism (Öner et al., 2016). De exemplu, Srikanth et al. (2015) au investigat efectele parametrilor de fermentare, inclusiv pH-ul inițial, suplimentarea levanților, concentrația de zaharoză, sursa de azot, concentrația inoculului și timpul de cultivare asupra sintezei levanților, utilizând Acetobacter xylinum NCIM2526 ca tulpină producătoare. Condițiile optime au fost stabilite la 10, 50-60 și 1,49 g/L pentru azot, zaharoză și, respectiv, inocul. Producția de levan a crescut considerabil după primele 24 de ore, iar productivitatea maximă a levanului a fost obținută după 122 de ore, când pH-ul inițial a fost stabilit la 6,8. Creșterea suplimentării inițiale a levanului de la 0,1 la 0,4 g/L a crescut producția de levan de la 1,22 la 1,65 g/L; orice cantitate mai mare de 0,4 g/L nu a mai avut nicio creștere a producției. Concentrațiile de inocul între 5% (v/v) și 10% (v/v) au dus la o modificare a randamentului de levanți, așa cum era de așteptat, iar randamentul maxim (1,46 g/L) a fost atins la 7% (v/v). Concentrațiile de zaharoză cuprinse între 20 și 80 g/L au afectat randamentul levanților. În intervalul 40-50 g/L randamentul de producție a crescut, în intervalul 70-80 g/L a scăzut, iar în intervalul 20-40 g/L nu s-a modificat.

Sarilmiser et al. (2015) au studiat producția de levan într-un microorganism halofil (Halomonas smyrnensis AAD6T) folosind diverși factori de stimulare. De exemplu, au fost aplicate diverse strategii de hrănire la diferite intervale de timp într-un sistem de biorreactor discontinuu și au fost testate mai multe condiții inițiale în culturile agitate. Dintre diferitele concentrații de pH și de zaharoză testate, producția maximă de levanți a fost obținută la pH 7 (1,345 g/L de levanți) și 50 g/L de zaharoză (1,320 g/L de levanți). Atunci când s-au aplicat limitări de azot și fosfor, atât concentrația de levan, cât și biomasa au scăzut, în timp ce valorile Yp/x au crescut. Strategiile de pulsare a azotului au scăzut sinteza levanului din cauza perioadei de creștere prelungite, strategiile de pulsare a zaharozei au îmbunătățit semnificativ creșterea celulară și producția de levan, iar pulsarea cu NaCl nu a avut niciun impact asupra creșterii. În mod interesant, culturile cultivate în prezența acidului boric au produs cele mai mari concentrații de levan (8,84 g/L) în condiții de bioreactor controlat. Această îmbunătățire a fost explicată prin fenomenul biologic cunoscut sub numele de quorum sensing (QS), în care sunt implicați atomi de bor; una dintre moleculele de semnalizare implicate în QS în H. smyrnensis AAD6T a fost identificată ulterior ca fiind o C16-acetilhomoserinelactonă (Abbamondi et al., 2016).

Greutatea moleculară a levanului este un factor decisiv în aplicabilitatea sa în diverse industrii, inclusiv în industria alimentară, cosmetică și medicală (Belghith et al., 1996). Determinarea condițiilor optimizate pentru producerea levanului este vitală pentru obținerea compusului cu greutatea moleculară dorită (Porras-Domínguez et al., 2015). De exemplu, Wu et al. (2013) au evaluat modificări subtile în procesul de producție pentru a dobândi diferite greutăți moleculare ale levanului în sisteme discontinue și alimentate, utilizând Bacillus subtilis (natto) Takahashi ca tulpină producătoare. Atunci când au fost aplicate concentrații ridicate (400 g/L) și scăzute (20 g/L) de zaharoză, au fost obținute greutăți moleculare mai mici și, respectiv, mai mari de levanți. Această relație liniară a fost atribuită efectului zaharozei asupra enzimei levansucrase. Autorii au concluzionat că greutatea moleculară a levanului a depins de condițiile de reacție, cum ar fi pH-ul, temperatura, viteza de agitare și zaharoza, aceasta din urmă fiind cel mai eficient factor care determină greutatea moleculară a levanului.

Producția de levan în sisteme de celule imobilizate este, de asemenea, avantajoasă, deoarece astfel de sisteme beneficiază de procese în aval relativ ușoare, de o productivitate volumetrică ridicată, de un control avansat al procesului și de un risc redus de contaminare în producția de EPS (Ürküt et al., 2007). Punerea în aplicare a acestei metode favorabile pentru producția de levanți poate fi utilizată o alternativă la procesele discontinue, de tip fed-batch și continue (Öner et al., 2016). De exemplu, Silbir și colab. (2014) au testat producția de levan în sisteme de fermentare discontinue și continue folosind Zymomonas mobilis B-14023. Producțiile de fermentare continuă au fost efectuate într-un bioreactor cu pat compact care utilizează celule imobilizate cu Ca-alginat. Timpul de incubare, pH-ul inițial și concentrația de substrat au fost cele mai importante trei variabile de proces pentru producția de levan în sistem discontinuu. Cea mai mare cantitate de levan (40,2 g/L) a fost produsă atunci când extractul de drojdie a fost utilizat ca sursă de azot organic în culturile de tip shake-flask. În plus, celulele de Z. mobilis imobilizate în sistemul de fermentare continuă au fost aplicate cu succes pentru producția de levan. Scăderile incontrolabile ale presiunii din sistem și întreruperea perlelor de gel de Ca-alginat au fost principalele limitări ale duratei mai lungi de fermentare.

În ciuda diversității microorganismelor producătoare de levan, costurile de producție pentru polizaharida levan rămân ridicate. Acesta este probabil cel mai mare blocaj în comercializarea sa (Öner et al., 2016; Sarilmiser et al., 2015). Mediile de fermentare reprezintă aproximativ 50% din costurile de producție pentru un proces microbian (Van Hoek et al., 2003); cu toate acestea, surse de carbon ieftine, cum ar fi siropurile și melasa, au fost utilizate anterior pentru producția microbiană de levanți (Özcan și Öner, 2015). Kucukasik et al. (2011) au investigat melasa de sfeclă de zahăr și melasa de amidon ca înlocuitori de zaharoză în culturile de Halomonas. Clarificarea, pH-ul, acidul sulfuric, fosfatul tricalcic și pretratamentele cu cărbune activ au fost utilizate în diferite combinații pentru a ajusta disponibilitatea chimică pentru producția de levanți. S-a ajuns la concluzia că randamentele maxime de levan au fost obținute la o concentrație de 10 g/L de TCPHAC sunt de 4,19 și, respectiv, 3,68 g/L. La utilizarea a 30 g/L de TCPHAC și HAC, s-au obținut randamente de levan de 7,56 și 4,44 g/L. Eliminarea metalelor grele și creșterea concentrației de fier au dus la o scădere a integrității celulare și a randamentului levanților în acest studiu. În alte studii, melasa neagră de trestie de zahăr în culturile de Bacillus lentus V8 (Abou-Taleb et al., 2015), siropul de curmale în culturile de Mycobacterium levaniformis 1406 (Moosavi-Nasab et al., 2010), melasă de sfeclă de zahăr în culturi de Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 (Han și Watson, 1992) și melasă și sirop de trestie de zahăr în culturi de Z. mobilis ATCC 31821 (De Oliveira et al., 2007) au fost investigate ca surse de carbon cu costuri reduse pentru producția de levan.

Biosinteza levanului în sistemele de fermentare submersă este limitată de cerința de creștere celulară care poate să nu îndeplinească condițiile optime pentru o activitate ridicată a levansucrasei (Santos-Moriano et al., 2015). Cu toate acestea, sistemele fără celule elimină această limitare și oferă beneficii suplimentare, cum ar fi pregătirea ușoară, reutilizarea și controlul modificărilor microambientale (Jang et al., 2001). Din acest motiv, oferirea unui mediu optim pentru levansucrare este crucială. De exemplu, Lu et al. (2014) au examinat influența diferiților factori, cum ar fi concentrația de substrat, timpul de reacție, temperatura și pH-ul asupra producției de levansucrasă utilizând levansucrasă recombinantă într-un sistem fără celule. Ei au observat un randament maxim de levan (7,1 g/L) folosind 0,8 M de zaharoză, pH 6,5 și 40°C timp de 24 h. Randamentul de levan a crescut în paralel cu o creștere a concentrației de zaharoză de la 0 la 0,8 M. Studiul lor a arătat că enzima recombinantă prezintă proprietăți biochimice similare cu enzima nativă.

.