Culturi celulare și RNAi

Linia celulară S2 de Drosophila melanogaster (din colecția IMG RAS) și linia celulară Kc167 (de la Drosophila Genomics Resource Center) au fost cultivate la 25 °C în mediul Schneider’s Drosophila Medium (Gibco) suplimentat cu 10% de agent termic-inactivat fetal bovin (FBS, Gibco), 50 unități/ml de penicilină și 50 µg/ml de streptomicină. OSCs47 furnizate cu amabilitate de M. Siomi au fost cultivate în mediu pentru insecte Shields și Sang M3 (Sigma-Aldrich) suplimentat cu 10% FBS inactivat termic (Gibco), 10% extract de muscă (http://biology.st-andrews.ac.uk/sites/flycell/flyextract.html), 10 µg/ml insulină (Sigma-Aldrich), 0,6 mg/ml glutation (Sigma-Aldrich), 50 unități/ml penicilină și 50 µg/ml streptomicină. ARNdb împotriva lacZ sau lamin Dm0 pentru tratamentul ARNi al celulelor S2 au fost preparate așa cum a fost descris anterior11. ARNdb împotriva LBR au fost preparate în același mod, utilizând ADN-ul genomului de Drosophila ca șablon pentru amplificarea PCR și primeri furnizați în tabelul suplimentar 1. Tratamentul celulelor cu ARNdS s-a efectuat pe parcursul a patru zile, folosind un protocol descris anterior48.

Analiză Western-blot

Proteinele au fost extrase cu 8 M uree, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 1% SDS, fracționate prin SDS-PAGE (gel de acrilamidă 12%) și transferate pe o membrană PVDF (Immobilon-P, Millipore). Blocurile au fost dezvoltate folosind anticorpi secundari conjugați cu fosfatază alcalină (Sigma) și sistemul de detecție Immun-Star AP (Bio-Rad). Următorii anticorpi au fost utilizați pentru detecție: monoclonal murin anti-lamină Dm0 (1:2000; ADL6749), policlonal de iepure anti-lamină C25 (1:10000), monoclonal murin anti-beta Actin (1:3000; ab8224, Abcam).

Vizualizarea cromatinei prin colorarea histonei H4 sau DAPI

Celele Lam-KD, LBR-KD sau celulele S2 de control au fost însămânțate pe lamboane de acoperire timp de 30 min. După clătirea cu PBS, celulele au fost fixate în metanol 100% timp de 5 min la temperatura camerei (pentru examinarea ulterioară a distribuției cromatinei pe baza imunocolorației histonei H4) sau în formaldehidă 4% în PBS timp de 25 min la temperatura camerei (pentru estimarea ulterioară a volumului de cromatină pe baza colorației DAPI), clătite cu PBS de trei ori, blocate cu PBTX (PBS cu 0,1% Tween-20 și 0,3% Triton X-100) conținând 3% ser normal de capră (Invitrogen) timp de 1 h la temperatura camerei. Restul procedurii de imunomarcație a fost efectuată conform descrierii anterioare50. Ca anticorpi primari am utilizat anticorpi monoclonali murini anti-histonă H4 (1:200; ab31830, Abcam), anticorpi policlonali de cobai anti-LBR26 (1:1000), anticorpi policlonali de iepure anti-lamină Dm051 (1:500). Ca anticorpi secundari am folosit IgG de capră anti-rabbit conjugate cu Alexa Fluor 546 (Invitrogen) sau IgG de capră anti-șoarece conjugate cu Alexa Fluor 488 (Invitrogen), sau IgG de capră anti-porcușor de Guineea conjugate cu Alexa Fluor 633 (Invitrogen).

Cuantificarea prin ImageJ a distribuției cromatinei

Utilizând ImageJ, am măsurat profilurile histonei H4, LBR și lamin Dm0 de-a lungul diametrului nucleului din planul focal ecuatorial al nucleelor celulelor Lam-KD, LBR-KD sau al celulelor S2 de control. Au fost extrase intensitățile fluorescente, profilurile individuale au fost mai întâi normalizate în funcție de intensitatea medie, apoi în funcție de diametrul nucleului (delimitat de vârfurile de fluorescență LBR pentru Lam-KD sau de vârfurile de fluorescență lamin Dm0 pentru LBR-KD) și aliniate în continuare pentru a determina profilul mediu. Au fost analizate nucleele din 2-3 experimente independente (60 de nuclee per experiment).

Estimarea volumului de cromatină colorată cu DAPI

Imaginile focale care conțin 20-30 de celule Lam-KD sau celule S2 de control fixate în formaldehidă și colorate cu DAPI au fost procesate și analizate cu aceiași parametri cu ajutorul software-ului IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG). Doar nucleele cu cea mai mică colorare reziduală a lamin Dm0 au fost utilizate pentru analiză în celulele Lam-KD, în timp ce în celulele de control, dimpotrivă, nucleele cu colorare slabă a lamin Dm0 nu au fost luate pentru analiză. Pentru sustragerea fondului, imaginile au fost supuse unui prag de ~15% din intensitatea maximă a canalului, astfel încât suprafețele nucleare generate să nu se extindă dincolo de vârful intensității fluorescenței LBR. Cu acești parametri, suprafețele nucleelor, adecvate pentru analiză, au fost reconstruite automat. În cele din urmă, volumele a ~100 de nuclee reconstruite au fost preluate din fila Statistics pentru analiză.

Two-colour FISH

~20-kb sonde FISH au fost generate cu ajutorul unui kit PCR cu rază lungă de acțiune (Encyclo Plus PCR (Evrogen)) prin PCR-amplificarea a 4 fragmente de genom de tiling care acoperă fie regiunea 2 L:16964000-16982000, fie regiunea 2 L:17310000-17328000, cu utilizarea perechilor de primer furnizate în tabelul suplimentar 1. 1 µg de ADN șablon pentru hibridizare a fost marcat prin sinteză cu amorsă aleatorie cu ajutorul kitului de marcare DIG DNA (Roche) sau cu ChromaTide Alexa Fluor 546-14-dUTP (Life Technologies). Sondele au fost combinate ulterior și hibridizate cu celule S2, așa cum s-a descris anterior23. Pentru detectarea sondei NL sau FISH, ca anticorpi primari am utilizat anticorpi policlonali de cobai anti-LBR26 (1:1000), sau policlonali de iepure anti-lamină Dm051 (1:500) și policlonali de oaie anti-DIG-FITC (1:500, Roche). Ca și anticorpi secundari am folosit IgG de capră anti-porcușor de Guineea conjugate cu Alexa Fluor 633 (Invitrogen), sau IgG de capră anti-rabit conjugate cu Alexa Fluor 546 (Invitrogen) și IgG de capră anti-FITC conjugate cu Alexa Fluor 488 (Invitrogen).

Măsurarea distanțelor dintre sondele FISH și NE

Stackurile de imagini tridimensionale au fost înregistrate cu un microscop confocal LSM 510 Meta laser scanning microscope (Zeiss). Au fost capturate secțiuni optice cu intervale de 0,4 μm de-a lungul axei Z. Imaginile au fost prelucrate și analizate cu ajutorul software-ului IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG) cu configurația experimentală oarbă. Distanțele dintre cele două sonde sau dintre sonde și NE au fost numărate așa cum a fost descris anterior23. Pe scurt, nu am reușit să reconstruim complet suprafețele nucleelor în mod automat pe baza imunocolorației LBR sau lamin Dm0 a acestora. Prin urmare, marginea nucleară a unui anumit nucleu a fost conturată manual în toate secțiunile optice ale stivei prin mijlocul colorației sale LBR sau lamin Dm0 pentru a reconstrui în continuare suprafața acestui nucleu în mod automat. Pentru a determina distanța dintre semnalele FISH și NE, „punctul de măsurare” al instrumentului a fost poziționat pe cel mai luminos voxel al sondei FISH și un alt „punct de măsurare” a fost poziționat pe suprafața nucleară reconstruită în punctul de intersecție cel mai timpuriu cu o sferă care crește progresiv de la primul „punct de măsurare”. Distanța dintre două „puncte de măsurare” (adică cea mai scurtă distanță dintre centrul sondei FISH și mijlocul NE) a fost măsurată pentru fiecare nucleu. Distanțele dintre două sonde FISH au fost măsurate în mod corespunzător. Datele au fost obținute în două experimente independente pentru 75-100 de nuclee per experiment. În paralel, s-au recuperat volumele nucleelor și s-au calculat razele nucleelor, considerând că acestea sunt sferice. În cele din urmă, distanțele au fost normalizate în funcție de razele nucleare.

Analiza expresiei genice

ARN total a fost izolat din celulele Lam-KD sau din celulele S2 de control folosind reactivul Trizol (Invitrogen), iar ADN-ul contaminant a fost eliminat prin tratament cu DNază I. Calitatea ARN-ului a fost evaluată prin electroforeză capilară cu un Bioanalyzer 2100 (Agilent). ARN poli(A)+ a fost extras din ARN total cu ajutorul perlelor magnetice de oligo(dT) (Thermo Fisher Scientific). Kitul de pregătire a bibliotecilor de ARN NEBNext Ultra II (New England Biolabs) a fost utilizat pentru pregătirea bibliotecilor în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Bibliotecile provenite din două replici biologice ale celulelor Lam-KD sau ale celulelor S2 de control au fost cuantificate cu ajutorul unui fluorimetru Qubit și al PCR cantitativ și au fost secvențiate pe Illumina NextSeq, rezultând 8,4-9,4 × 106 citiri single-end de 80 nt. Citirile au fost mapate pe genomul de referință D. melanogaster (versiunea dm3) utilizând HISAT52 v2.1.0 cu opțiunea -max-intronlen 50 000. Citirile cu o calitate scăzută a cartografierii au fost eliminate cu ajutorul SAMtools53 cu opțiunea -q 30. Am calculat nivelurile de transcripție log2 în bini genomici de 20-kb folosind BEDtools54 v2.16.2 cu opțiunea -split, apoi am aplicat funcția hclust din R pentru a grupa replicile folosind coeficientul de corelație 1-Spearman ca metrică de distanță. Expresia genelor a fost cuantificată cu StringTie52 pentru versiunea de adnotare de referință r5.12. Am filtrat genele cu expresie zero în mai mult de două replici. Dintre cele 10 076 de gene rămase, genele cu expresie diferențiată au fost definite cu ajutorul pachetului edgeR55 cu normalizarea mediei tăiate a valorilor M (TMM) la cutoff FDR = 0,05. Genele au fost atribuite la LAD-uri dacă TSS-urile lor au fost localizate în cadrul LAD-urilor, în timp ce genele au fost atribuite la inter-LAD-uri dacă TSS-urile lor au fost la cel puțin 1 kb distanță de LAD-uri. La toate valorile de expresie a fost adăugat un pseudocount pentru a elimina zerourile. Pseudocount a fost calculat ca fiind valoarea minimă din tabelul de expresie a genelor după normalizare. Apoi, am făcut media replicilor și am calculat valorile log2(FC) între eșantioanele Lam-KD și cele de control.

Sesizarea RT-qPCR în timp real pentru genele selectate aleatoriu din diferite LAD a fost efectuată pe ADNc sintetizate cu primeri oligo(dT) pe ARN poli(A)+ izolat din 3 replici biologice de celule Lam-KD sau de celule S2 de control, utilizând chimia EvaGreen (Jena Bioscience) și hardware-ul CFX96 (BioRad). Nivelurile de expresie ale genelor au fost normalizate în funcție de expresia genei act5C. Pentru RT-PCR semi-cantitativă, aplicată pentru analiza genelor din LAD 60D, s-a efectuat transcrierea inversă a ARN-ului cu ajutorul transcriptazei inverse SuperScript II (Invitrogen) în prezența unor amorse aleatoare hexamerice. Amplificarea PCR a ADNc a fost realizată cu adăugarea de 33P-dATP. Sondele după PCR au fost separate în PAAG 5%, care a fost apoi fixat, uscat și expus la ecranul cu fosfor de stocare (Amersham Biosciences). Semnalele au fost scanate cu un Phosphorimager Storm-820 (Molecular Dynamics). Pentru fiecare pereche de amorsă, numărul de cicluri PCR a fost optimizat pentru a se potrivi cu faza exponențială de amplificare, care a fost controlată prin diluția de două ori a ADNc. Nivelurile de expresie ale genelor au fost normalizate în funcție de expresia genei omniprezente CG4589. Secvențele primerilor specifici genelor sunt prezentate în tabelul suplimentar 1.

Procedura ChIP-seq și analiza datelor

ChIP-seq din două replici biologice de celule S2 de control și Lam-KD cu anticorpi acetilați anti-H3-pan (Active Motif, #39139) a fost realizată așa cum a fost descrisă anterior56, cu unele modificări. După clătirea cu PBS, ~2 × 107 celule au fost fixate cu 1,8% formaldehidă în PBS conținând 0,5 mM DTT timp de 20 min la temperatura camerei. Reticularea a fost oprită prin adăugarea de glicină la 225 mM timp de 5 min și spălarea în PBS conținând 0,5 mM DTT de trei ori timp de 5 min. Celulele au fost spălate o dată în tamponul A2 (140 mM NaCl, 15 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,1% deoxicolat de sodiu, 0,5 mM DTT, cocktail complet de inhibitori de protează fără EDTA (Roche)). Celulele au fost lizate în tamponul A2 care conține 1% SDS timp de 10 minute la temperatura camerei, după care lizatul a fost diluat de 20 de ori cu tamponul A2 și incubat timp de 2 minute la 4 °C. După sonicare cu VCX 400 Vibra-Cell Processor (Sonics; 30 de impulsuri de 10 secunde cu intervale de 10 secunde la o putere maximă de 15 %) și centrifugare de 10 minute la mare viteză, cromatina fragmentată (cu o dimensiune medie a fragmentului de ADN de ~0,5 kb) a fost recuperată în supranatural. Pentru fiecare imunoprecipitare, ~10 μg de cromatină (~700 µl) au fost pre-incubate în prezența a 100 μl de Proteină A-Sepharose (PAS, 50% p/v, GE Healthcare) timp de 1 h la 4 °C. PAS a fost îndepărtat prin centrifugare, 5% din cromatină a fost izolată ca material „Input”, după care 2 µl de anticorpi anti-H3-pan acetilați (Active Motif, #39139) au fost adăugați la restul cromatinei, iar probele au fost incubate peste noapte la 4 °C într-o roată rotativă. Apoi, s-au adăugat 100 μl de PAS și s-a continuat incubarea timp de 4 h la 4 °C. Probele au fost centrifugate la viteză maximă timp de 1 minut, iar supernatantul a fost aruncat. Probele au fost spălate de patru ori în tamponul A2 care conține 0,05% SDS și de două ori în tamponul 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 0,5 mM DTT (fiecare spălare timp de 5 minute la 4 °C). Cromatina a fost eluată din PAS în 100 μl de 10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM Tris (pH 8) la 65 °C timp de 10 minute, urmată de centrifugare și recuperarea supernatantului. Materialul PAS a fost re-extras în 150 μl de TE, 0,67% SDS. Pentru a inversa legăturile încrucișate, eluatul combinat (250 μl) a fost incubat 6 h la 65 °C și tratat cu Proteinaza K timp de 3 h la 50 °C. Probele au fost extrase cu fenol-cloroform și precipitate cu izopropanol în prezența a 20 μg de glicogen. ADN-ul a fost dizolvat în 100 μl de apă. Probele ChIP conținând ~25 ng de ADN precipitat, precum și probele „Input” au fost pregătite pentru secvențierea de generație următoare cu ajutorul unui kit de pregătire a bibliotecilor de ADN NEBNext Ultra II pentru Illumina (New England Biolabs). Bibliotecile au fost secvențiate pe Illumina HiSeq 2000, rezultând 3,1-3,4 × 106 lecturi single-end de 75-bp. Lecturile au fost mapate pe genomul de referință D. melanogaster (versiunea dm3) utilizând Bowtie 2 v2.2.1 (cu opțiunea -very-sensitive)57. Citirile cu o calitate scăzută a cartografierii au fost eliminate cu ajutorul SAMtools53 cu opțiunea -q 30. Lecturile duplicate au fost eliminate cu ajutorul SAMtools rmdup. Am calculat log2 ChIP și semnalele de intrare în bini genomici de 1 kb folosind BEDtools54 v2.16.2, apoi am aplicat funcția hclust din R pentru a grupa replicile folosind coeficientul de corelație 1-Spearman ca metrică de distanță. Citirile au fost atribuite la LAD-uri dacă se suprapuneau cu LAD-uri, în timp ce citirile au fost atribuite la inter-LAD-uri dacă se aflau la o distanță de cel puțin 1 kb de LAD-uri. Am calculat numărul de citiri în cadrul fiecărui LAD și inter-LAD, am normalizat valorile pentru suma acoperirii citirilor pentru fiecare replică, am exclus LAD-urile și inter-LAD-urile cu acoperire zero din analiza ulterioară, am calculat media replicilor și am calculat valorile log2(FC) între probele ChIP Lam-KD și cele de control.

Procedura Hi-C și analiza datelor

Bibliotecile Hi-C din două replici biologice independente de celule S2 de control și Lam-KD au fost pregătite în esență așa cum a fost descris anterior36 , folosind enzima de restricție HindIII-HF (NEB). Bibliotecile au fost secvențiate pe platforma Illumina HiSeq 2000, rezultând 3-4 × 107 lecturi de tip paired-end. Lecturile au fost mapate pe genomul de referință D. melanogaster (versiunea dm3) utilizând Bowtie 2 v2.2.1 (cu opțiunea -very-sensitive)57. Datele Hi-C au fost prelucrate cu ajutorul pipeline-ului ICE v0.9 (20 de iterații de corecție iterativă), așa cum este descris58. S-au obținut hărți de interacțiune Hi-C cu o rezoluție de 20-kb. TAD-urile au fost prezise cu ajutorul software-ului Armatus59 v1.0, în care dimensiunea medie și numărul de TAD-uri sunt determinate de parametrul de scalare γ. Adnotarea TAD-urilor a fost realizată în două etape, așa cum este descris36. În primul rând, am selectat manual parametrul γ pentru a obține o bună compartimentare a TAD-urilor (γ = 1,20 pentru celulele Lam-KD și γ = 1,12 pentru celulele de control). Apoi, TAD-urile mai mari de 600 kb au fost împărțite în TAD-uri mai mici cu parametrul de scalare γ înmulțit cu 2. După aceea, cele mai mici TAD-uri (egale sau mai mici de 60 kb) au fost notate ca fiind inter-TAD-uri din cauza structurii lor interne slab rezolvate. Ca urmare, au fost evidențiate 576 (în cazul controlului) și 588 (în cazul Lam-KD) de TAD-uri. Pentru a examina dacă pozițiile TAD sunt modificate în cazul Lam-KD, am analizat gradul de suprapunere a fiecărui TAD în replicile fuzionate ale celulelor de control și Lam-KD cu cel din replicile de control sau din replicile Lam-KD și nu am găsit o diferență semnificativă din punct de vedere statistic (P > 0,05 într-un test Wilcoxon cu două fețe). ACF în cadrul fiecărui TAD a fost calculat ca valoare medie a numerelor de citire corectate iterativ între toate binarele genomice aparținând TAD, excluzând binarele de graniță din ambele părți ale TAD. ACF în cadrul fiecărui TTAD a fost calculată ca valoare medie a numerelor de citire corectate iterativ între toate binarele genomice aparținând TTAD-ului și binarele limită ale TAD-urilor adiacente. Pentru fiecare TAD, am calculat raportul dintre valoarea ACF în fiecare replică Lam-KD și valoarea ACF în fiecare replică de control (patru rapoarte în total). TAD-urile cu cel puțin trei rapoarte de același semn au fost utilizate pentru analiza din aval. Observăm că atunci când am selectat TAD-urile în conformitate cu un criteriu mai strict (adică toate cele patru rapoarte au fost modificate în aceeași direcție), acest lucru nu a afectat rezultatele analizei (Fig. suplimentară 6). Compartimentele de cromatină au fost adnotate cu ajutorul analizei componentelor principale, așa cum s-a descris17. Graficele Saddle au fost generate conform descrierii58. Pe scurt, am utilizat hărțile Hi-C observate/prevăzute, pe care le-am calculat din hărțile de interacțiune corectate iterativ la 20-kb de interacțiuni cis-interacțiuni prin împărțirea fiecărei diagonale a unei matrice la valoarea sa medie la nivelul întregului cromozom. În fiecare hartă observată/sperată, am rearanjat rândurile și coloanele în ordinea creșterii valorilor PC1 (pe care le-am calculat pentru matricile de control). În cele din urmă, am agregat rândurile și coloanele din matricea rezultată în 20 de bini agregate de dimensiuni egale, obținând astfel un grafic de compartimentare în șa.

Analiza datelor publicate

Am folosit adnotarea tipului de cromatină pentru celulele S240. Au fost calculate proporțiile tipurilor de cromatină în bini de 20-kb. Adnotarea LAD-urilor a fost obținută din ref. 28. Am calculat proporția lungimii LAD în fiecare bin TAD de 20-kb.

Modelarea polimerilor

Am folosit Dissipative Particle Dynamics (DPD) pentru a efectua simulări pe calculator, așa cum a fost descris anterior36 cu unele modificări. Pe scurt, macromoleculele sunt reprezentate în termenii modelului de mărgele și arcuri, cu particule care interacționează printr-o forță conservativă (repulsie), o forță disipativă (frecare) și o forță aleatorie (generator de căldură). O descriere detaliată a implementării acestei tehnici a fost furnizată anterior60. Volumul celulei simulate a fost de 50 × 50 × 50 × 50 unități DPD, densitatea este egală cu 3, astfel încât numărul total de particule din sistem este de 375 000. Presupunem că o particulă corespunde unui nucleozom. În plus, introducem condiții la limită speciale, care sunt periodice pentru solvent și impermeabile pentru celelalte particule. Suprafața este formată din particule imobile, poziționate hexagonal. În simulările noastre, particulele imită fie tipul de nucleozom „activ”, fie tipul de nucleozom „inactiv”, în timp ce suprafața imită NL. Particulele „inactive” pot crea legături de „saturație” reversibile61,62 între ele, precum și cu particulele unei suprafețe. Fiecare particulă „inactivă” poate avea doar o singură legătură suplimentară pe moment, ceea ce simulează o interacțiune a unei cozi histonice încărcate pozitiv a nucleozomului neacetilat cu „pata acidă” a unui alt nucleozom42,43,63. Lanțul nostru copolimeric este reprezentat de 64 de blocuri, fiecare constând din 500 de particule „inactive” și 50 de particule „active”. Probabilitatea de a crea o asociere între două particule „inactive” a fost stabilită la 0,001, între particula „inactivă” și suprafață – 0,007, în timp ce probabilitatea de a rupe o astfel de asociere a fost stabilită la 0,01. În timpul simulărilor, toate particulele au fost verificate la fiecare 200 de pași DPD, când s-a obținut echilibrul local. Am efectuat 10 rulări independente pe supercomputerul MSU „Lomonosov-2” folosind propria noastră implementare pentru codul DPD paralelizat de descompunere a domeniului, care este disponibil pe GitHub .

Analiză statistică

Am aplicat testul Wilcoxon pentru a verifica dacă distribuția valorilor log2(FC) a fost simetrică în jurul valorii zero, precum și pentru a testa dacă două distribuții ale valorilor log2(FC) diferă printr-un decalaj de locație de zero.

Rezumat de raportare

Mai multe informații despre designul experimental sunt disponibile în Rezumatul de raportare Nature Research legat de acest articol.

.