Asamblarea și adnotarea genomului meduzelor

Acum, prezentăm prima asamblare de novo a genomului meduzei Nomura (Nemopilema nomurai; Fig. 1b). A rezultat un genom de 213 Mb compus din 255 de schele și o lungime N50 de 2,71 Mb, conținând doar 1,48% de lacune (Fișierul suplimentar 1: tabelele S2 și S3). Ansamblul hibrid Nemopilema a fost creat cu ajutorul unei combinații de tehnologii de secvențiere cu citire scurtă și lungă, constând în 38,2 Gb de citiri de secvențiere în timp real cu o singură moleculă (SMRT) de la Pacific Biosciences (PacBio), împreună cu 98,6 Gb de citiri lungi sintetice Illumina cu inserție scurtă, perechi de perechi și TruSeq (Fișier suplimentar 1: Figurile S3-S5; Tabelele S4-S7). Ansamblul rezultat prezintă cea mai lungă continuitate dintre genomurile de cnidari (Fișier suplimentar 1: Tabelul S9). Am prezis 18 962 de gene de meduză codificatoare de proteine prin combinarea metodelor de novo (utilizând transcriptomii de țesut de clopot de meduză și de tentacule) și a metodelor de prezicere a genelor omologe (Fișier suplimentar 1: Tabelele S10 și S11, Fișiere suplimentare 2 și 3). Acest proces a recuperat cel mai mare număr de gene omologe cu o singură copie dintre toate ansamblurile de genomuri de metazoare non-bilateriane publicate până în prezent (Fișier suplimentar 1: Tabelul S12). S-a constatat că un total de 21,07% din genomul meduzelor este alcătuit din elemente transpozabile, în comparație cu cele ale Acropora digitifera (9,45%), Nematostella vectensis (33,63%) și Hydra vulgaris (42,87%) (Fișier suplimentar 1: Tabelul S13).

Am comparat genomul Nemopilema cu alte genomuri de cnidari, inclusiv cu genomurile Aurelia aurita și Clytia hemisphaerica publicate recent , toate provenind de la taxoni predominant sesili, pentru a detecta funcția unică a Scyphozoa (mobilitate activă), structura fizică (clopotul meduzei) și chimia (venin). Am efectuat, de asemenea, analize ale transcriptomului atât la Nemopilema nomurai, cât și la meduza Sanderia malayensis în trei tipuri de țesuturi de meduză și în patru stadii de dezvoltare.

Analiză evolutivă a meduzelor

Pentru a identifica trăsăturile evolutive specifice meduzelor, am examinat expansiunile și contracțiile familiilor de gene la un holozoar unicelular și la 13 metazoare, folosind 18.458 de familii de gene ortologe (a se vedea Fișierul suplimentar 1: Secțiunea 4.1). Dintre acestea, 10 434 au fost găsite în Nemopilema și 6764 au fost împărtășite de toate cele trei clase cnidare disponibile (Scyphozoa: Nemopilema nomurai și Aurelia aurita; Hydrozoa: Hydra vulgaris , Clytia hemisphaerica; Anthozoa: Acropora digitifera și Nematostella vectensis ; Fig. 2a). O filogenie construită cu ajutorul acestor ortologi a dezvăluit o cladă monofilitică de cnidari care a deviat de la tulpina metazoarelor înainte de evoluția bilaterilor (Fig. 2b; Fișier suplimentar 1: Figura S7). Pentru a determina câte gene au apărut în fiecare eră evolutivă în genomul meduzei Nomura, am evaluat, de asemenea, vârsta evolutivă a genelor codificatoare de proteine. Grupând genele meduzelor în trei ere evolutive mari, am observat că, în timp ce majoritatea (80%) genelor sunt vechi (mai vechi de 741 Mya), câteva (~ 3%) au o vârstă intermediară (741-239 Mya), iar unele (17%) sunt tinere (239 Mya până în prezent; Fig. 2c; Fișier suplimentar 1: Figura S10). În mod interesant, normalizarea numărului de gene în funcție de vârsta și de durata erei evolutive sugerează că rotația genelor este cea mai mare în apropierea timpului prezent. În total, genomul Nemopilemei conținea 123 de familii de gene extinse și 164 de familii de gene contractate în comparație cu strămoșul comun al Nemopilemei și Aureliei (Fig. 2b; a se vedea Fișierul suplimentar 1: Secțiunea 4.2). Termenii Gene Ontology (GO) legați de percepția senzorială au fost subreprezentați în descendența Cnidaria în comparație cu Bilateria, reflectând cu exactitate sistemul senzorial mai puțin complex al cnidarianilor (Fișierul suplimentar 1: tabelele S14 și S15). Cu toate acestea, transportul de neurotransmițători (GO:0006836, P = 6,01E- 10) a fost semnificativ îmbogățit în descendența Scyphozoa în comparație cu strămoșul comun al Scyphozoa și Hydrozoa (Fișier suplimentar 1: Tabelele S16 și S17), probabil datorită structurilor de echilibru și vizuale, cum ar fi statocystul și ocelii, care sunt mai elaborate în meduza mobilă decât în polipii sesili . În comparație cu strămoșul comun al Nemopilema și Aurelia, Nemopilema a prezentat familii extinse de gene asociate cu activitățile metaloppeptidazelor (GO:0008237, P = 2,86E- 14; Fișier suplimentar 1: Tabelele S18 și S19). În plus, am găsit 1589 de familii de gene ortologe care sunt specifice Scyphozoa. Testele de îmbogățire a genelor specifice Scyfozoarelor au evidențiat termenii de transport al ionilor de sodiu, activitatea canalelor ionice și activitatea receptorilor de neurotransmițători (Fișier suplimentar 1: Tabelul S20).

Contextul genomic și genele asociate mușchilor

Meduzele au două tipuri primare de mușchi: celulele epiteliomusculare, care sunt celulele musculare predominante întâlnite la cnidariile sesile, și celulele musculare striate situate în clopotul meduzei, care sunt esențiale pentru înot. Pentru a înțelege evoluția înotului activ la meduze, am examinat prejudecata codonică a acestora în comparație cu alte metazoare prin calcularea conținutului de guanină și citosină la poziția a treia a codonului (GC3) (Fișier suplimentar 1: Figura S13). S-a sugerat că genele cu un nivel ridicat de GC3 sunt mai adaptabile la stresul extern (de exemplu, schimbările de mediu) . Printre primele 100 de gene predispuse GC3 cu punctaj ridicat, reglarea contracției musculare și căile de semnalizare a neuropeptidelor, termenii GO au fost specifici pentru Nemopilema (Fișierul suplimentar 4: tabelele S25 și S26). Calciul joacă un rol-cheie în contracția mușchilor striați la meduze, iar calea de semnalizare a calciului (GO:0004020, P = 5,60E- 10) a prezentat un nivel ridicat de prejudecăți GC3 specifice Nemopilemei. Nemopilema și Aurelia primele 500 de gene GC3 au fost îmbogățite în termeni GO asociați cu homeostazia (de ex, homeostazia chimică celulară și transportul ionilor de sodiu), ceea ce speculăm că este esențial pentru activarea contracțiilor musculare care alimentează prădarea mobilă a meduzei (Fișier suplimentar 1: Secțiunea 5.1; Fișier suplimentar 4: Tabelele S27 și S28).

Din moment ce s-a raportat că cnidariile sunt lipsite de complexele titină și troponină, care sunt componente critice ale mușchilor striați bilaterali, s-a sugerat că cele două clade au evoluat independent mușchii striați . Un studiu al genelor care codifică proteinele structurale și de reglare a mușchilor la cnidari a arătat o mașinărie contractilă eumetazoană de bază conservată de actină-miozină împărtășită cu bilaterienii (Fișier suplimentar 1: Tabelul S32). Cu toate acestea, la fel ca alte cnidare, Nemopilema nu are complexe de titină și troponină, care sunt componente cheie ale mușchilor striați bilaterali. De asemenea, γ-sintrofina, o componentă a complexului distroglican, a fost absentă la Nemopilema, Aurelia și Hydra. Cu toate acestea, Nemopilema și Aurelia posedă proteinele α/β-Dystrobrevin și α/ε-Sarcoglycan asociate distroglicanului, ceea ce indică faptul că mai multe componente ale complexului distroglican au fost pierdute după separarea Scyphozoa-Hydrozoa. S-a sugerat că Hydra a suferit simplificări secundare în raport cu Nematostella, care are un grad mai mare de specializare a tipului de celule musculare . În comparație cu Hydra și Nematostella, Nemopilema și Aurelia prezintă o complexitate intermediară a proteinelor structurale și de reglare a mușchilor între Hydra și Nematostella.

Profilarea transcriptomului clopotului de meduză și tentaculelor

Clopotul de meduză și tentaculele meduzelor sunt distincte din punct de vedere morfologic și îndeplinesc funcții fiziologice discrete . Am generat transcriptomi de clopot și tentacule de la Nemopilema și de la Sanderia malayensis, mai mică, care poate fi cultivată în laborator, pentru a evalua reglarea dezvoltării (Fișier suplimentar 1: Tabelul S29). Testele de îmbogățire a genelor puternic exprimate au arătat că categoriile funcționale asociate mușchilor (de exemplu, complexul miozinei musculare și morfogeneza țesutului muscular) au fost îmbogățite în clopot (Fig. 3a; Fișierul suplimentar 5: Tabelele S30-S33). Miozinele cuprind o superfamilie de proteine motorii și joacă un rol critic în contracția musculară și sunt implicate într-o gamă largă de procese de motilitate la eucariote. În mod critic, proteinele din familia Myosin II, care se găsesc atât în celulele din țesutul muscular striat, cât și în cele din țesutul muscular neted, sunt responsabile de producerea contracției în celulele musculare . Cnidarii posedă atât celule epiteliomusculare, cât și celule musculare striate. Mușchiul striat este o componentă esențială a subumbrelei clopotului de meduză, unde contracțiile sale rapide alimentează înotul unic bazat pe propulsie al meduzelor. Am descoperit că familiile de gene de tip II Myosin heavy chain (MYH) și Myosin light chain (MYL) au fost puternic exprimate în clopot și sunt strâns asociate cu celulele musculare striate și netede. În mod interesant, Nemopilema și Aurelia au prezentat cele mai mari numere de copii ale genelor MYH și MYL în rândul metazoarelor non-bilateriane (Fig. 3c; Fișier suplimentar 1: Figurile S14-S17; Tabelele S38-40), iar șase dintre cele șapte gene MYH și 12 dintre cele 21 de gene MYL din Nemopilema au prezentat o expresie mai mare în clopot decât în tentacule, cu o creștere medie foarte mare de ~ 8,8 și, respectiv, ~ 17 ori (Fig. 3d). Aceste rezultate sugerează că combinațiile de expansiune a numărului de copii ale familiilor de gene de miozină de tip II și expresia ridicată a genelor asociate mușchilor au confirmat faptul că mușchii din clopotul meduzei sunt un determinant important al motilității meduzelor.

În schimb, analizele de expresie genetică ale tentaculelor au evidențiat niveluri ridicate de expresie ARN ale categoriilor funcționale asociate cu neurotransmițătorii (complexul canalelor ionice, postsinapsa și activitatea receptorilor de neurotransmițători; Fig. 3b; Fișier adițional 5: Tabelele S34-S37); în concordanță cu anatomia tentaculelor meduzelor, care conțin celulele senzoriale și un plex liber al subpopulației neuronale la baza ectodermului .

Plasarea corpului la meduze

Au existat multe dezbateri în jurul evoluției timpurii a structurii corpului în strămoșul comun al metazoarelor, în special în ceea ce privește originea și expansiunea familiilor de gene Hox și Wnt . În total, 83 de homeodomuri au fost găsite la Nemopilema, în timp ce 82, 41, 120 și 148 de homeodomuri au fost găsite la Aurelia, Hydra, Acropora și, respectiv, Nematostella (Fișier suplimentar 1: Tabelul S41). Cinci dintre cele opt gene Hox din Nemopilema sunt de tip posterior care sunt asociate cu dezvoltarea axei aborale și s-au grupat cu genele Hox posterioare din Nematostella, HOXE și HOXF (Fișierul suplimentar 1: Figurile S18-S20). Aurelia are șase gene Hox de tip posterior, dar nu are genele de tip HOXB, C și D (HOX2 la om). Deși absente în Hydra și Acropora, analizele de sintenie ale genelor ParaHox din Nemopilema arată că gena XLOX/CDX este situată imediat în aval de GSX în aceeași orientare în tandem ca și cele din Nematostella, ceea ce sugerează că XLOX/CDX a fost prezentă în strămoșul comun al cnidariilor și a fost ulterior pierdută în unele neamuri (Fișier suplimentar 1: Figura S21). Genele legate de Hox, EVX și EMX, sunt, de asemenea, prezente în Nemopilema și Aurelia, deși sunt absente în Hydra. Având în vedere cantitatea mare de diversitate ancestrală a genelor Wnt, s-a propus că semnalizarea Wnt a controlat dezvoltarea planului corporal la metazoarele timpurii . Nemopilema posedă 13 ortologi Wnt reprezentând 10 subfamilii Wnt (Fișier suplimentar1: Figura S22; Tabelul S42). Wnt9 este absent de la toți cnidarii, reprezentând probabil pierderi în strămoșul comun al cnidarilor. Cnidarii au suferit duplicări dinamice ale subfamiliei Wnt specifice liniei de descendență, cum ar fi Wnt8 (Nematostella, Acropora și Aurelia), Wnt10 (Hydra) și Wnt11 și Wnt16 (Nemopilema și Aurelia). S-a propus ca un grup comun de gene Wnt (Wnt1-Wnt6-Wnt10) să fi existat în ultimul strămoș comun al artropodelor și al deuterostomilor . Analizele noastre de genomuri de cnidari și bilaterali au arătat că Acropora posedă, de asemenea, acest cluster, în timp ce Nemopilema, Aurelia și Hydra lipsesc Wnt6, sugerând pierderea genei Wnt6 în strămoșul comun al Medusozoarelor (Fișier suplimentar 1: Figura S23). Luate împreună, meduzele au un număr comparabil de gene Hox și Wnt cu cel al altor cnidari, dar repertoriul dinamic al acestor familii de gene sugerează că cnidariile au evoluat independent pentru a-și adapta caracteristicile fiziologice și ciclul de viață.

Tranziția de la polip la meduză la meduze

Tranziția de la polip la meduză este proeminentă la meduze în comparație cu celelalte cnidare sesile. Pentru a înțelege baza genetică a formării structurii meduzei la meduze, am comparat reglarea transcripțională între cnidari și între stadiile de dezvoltare ale meduzelor (a se vedea fișierul suplimentar 1: secțiunile 7.1 și 7.2). Am asamblat transcriptele Sanderia folosind șase eșantioane reunite de transcriptomi (Fișier suplimentar 1: Tabelul S43). Transcriptele asamblate au avut o lungime totală de 61 Mb și au rezultat 58 290 de izoforme de transcripte și 43 541 de transcripte unice, cu un N50 de 2325 bp. În medie, 87% din citirile ARN au fost aliniate în transcriptele asamblate (Fișier suplimentar 1: Tabelul S44), ceea ce indică faptul că ansamblul de transcripte a reprezentat majoritatea citirilor secvențiate. În plus, compoziția domeniilor proteice conținute în primele 20 de poziții a fost destul de similară între Nemopilema și Sanderia (Fișier suplimentar 1: Tabelul S45). Pentru a obține gene exprimate diferențiat pentru fiecare etapă, am comparat fiecare etapă cu etapa anterioară sau următoare din ciclul de viață al meduzelor. Stadiul de polip, care reprezintă un stadiu sesil în ciclul de viață al meduzei, a prezentat termeni îmbogățiți legați de activitatea canalelor ionice și de metabolismul energetic (reglarea procesului metabolic și procesul metabolic al aminoacizilor; fișier suplimentar 1: Tabelul S46). Hrănirea activă în polip stimulează proliferarea asexuată, fie în mai mulți polipi, fie metamorfoza în strobila . Deoarece antozoarele nu formează o meduză, stadiul de reproducere asexuată a strobila este un stadiu important în care se studiază metamorfoza de la polip la meduză. În acest stadiu, termenii GO legați de biosinteza amidelor și de procesele metabolice au fost foarte bine exprimați în comparație cu stadiul de polipi (Fișier suplimentar 1: Tabelul S47). S-a raportat că neuropeptidele RF-amidă și LW-amidă au fost asociate cu metamorfoza la cnidari . Cu toate acestea, nu am putut confirma această constatare în comparațiile noastre cu stadiile strobila și ephyra. În sistemul nostru, modelele de expresie a genelor din cele două stadii sunt destul de asemănătoare. În ephyra, stadiul mobil eliberat, termenii GO care implică procesul biosintetic și metabolic al amidelor au fost, de asemenea, foarte bine exprimați în comparație cu stadiul de meduză fuzionată (Fișier suplimentar 1: Tabelul S48). În meduză, au fost îmbogățiți termenii privind matricea extracelulară, activitatea metalopeptidazei și procesul sistemului imunitar (Fișier suplimentar 1: Tabelul S49), în concordanță cu fiziologia tipurilor lor de țesuturi de clopot, tentacule și braț oral.

Metamorfoza de la polipi la meduză s-a dovedit anterior a fi puternic asociată cu genele CL390 și ale receptorului X retinoid (RXR) la meduza Aurelia aurita . În mod interesant, CL390 nu a fost găsit la Nemopilema sau la alte cnidare publicate, ceea ce sugerează că ar putea fi o genă inductoare de strobilare specifică Aurelia. Cu toate acestea, confirmăm că RXR este prezentă la Nemopilema și absentă de la cnidari fără un stadiu de meduză (Fișier suplimentar 1: Figura S24). Semnalarea acidului retinoic (RA) joacă un rol central în timpul creșterii și dezvoltării vertebratelor , unde reglează transcripția prin interacțiunea cu receptorul RA (RAR) legat de elementele de răspuns RA (RARE) ale genelor țintă din apropiere . Dintre genele din calea de semnalizare a RA, Nemopilema posedă enzimele ADH și RALDH care metabolizează retinolul în RA, iar RXR și RAREs pentru a activa transcrierea genei țintă (Fig. 4a). Am descoperit 1630 de regiuni RARE din Nemopilema cu o distanță medie de 13 Kbp față de cea mai apropiată genă (Fig. 4b; Fișierul suplimentar 1: Tabelele S50 și S51). În mod interesant, patru gene Hox posterioare din Nemopilema și două gene Hox din Aurelia au fost localizate la o distanță de ± 10 Kbp de RARE-uri, ceea ce este unic printre metazoarele non-bilateriane (Fig. 4c; Fișier suplimentar 1: Tabelul S52). Împreună, aceste constatări sugerează că semnalizarea acidului retinoic a fost prezentă la metazoarele timpurii pentru reglarea genelor țintă cu RXR și RAREs și că RXR și RAREs pot juca un rol critic pentru metamorfoza de la polip la meduză .

Identificarea domeniilor legate de toxine în meduze

Meduzele produc amestecuri complexe de veninuri proteice pentru capturarea și apărarea activă a prăzii . Am identificat domenii abundente de toxine în Nemopilema în comparație cu seturile de gene de metazoare non-bilateriane din baza de date Tox-Prot . În total, 67 din 136 de domenii de toxine s-au aliniat la metazoare non-bilateriane; din aceste 67 de domenii de toxine, 52 au fost găsite în Nemopilema (Fișier suplimentar 1: Tabelul S53). În mod previzibil, genomul Nemopilema conține cel mai mare număr de domenii asociate veninului sau toxinei dintre metazoarele non-bilateriane incluse. Aceste domenii includ domenii de metaloprotează de zinc din familia Reprolysin (M12B) (PF01421), fosfolipază A2 (PF05826) și Prokineticin (PF06607) (Fig. 5). De asemenea, Nemopilema și Aurelia posedă 8 și, respectiv, 11 domenii asemănătoare domeniului ShK (PF01549), care sunt cele mai abundente la aceste specii în comparație cu alte specii de non-bilateri. În special, metaloproteazele de zinc din familia Reprolysin (M12B) sunt enzime care clivează peptide și cuprind majoritatea endopeptidazelor din veninul de șarpe . Mai mult, s-a raportat că domeniile inhibitor de serin protează și ShK au fost găsite din abundență în transcriptomul meduzei cu bilă de tun (Stomolophus meleagris) și al meduzei cu cutie (Chironex fleckeri) , iar fosfolipaza A2 este o enzimă bine caracterizată legată de toxine, care este esențială pentru producerea componentelor veninului, întâlnită în clasa Scyphozoa .

.