Abstract

Metabolismul celular depinde de concentrația adecvată de fosfat anorganic (Pi) intracelular. Genele care răspund la foametea de Pi par a fi implicate în mai multe căi metabolice, ceea ce implică un sistem complex de reglare a Pi în microorganisme și plante. Un grup de enzime este necesar pentru absorbția și menținerea unor niveluri adecvate de fosfat, care este eliberat din esterii și anhidridele de fosfat. Sistemul fosfatazei este deosebit de potrivit pentru studiul mecanismelor de reglare, deoarece activitatea fosfatazei este ușor de măsurat cu ajutorul unor metode specifice, iar diferența dintre nivelul reprimat și cel dereprimat al activității fosfatazei este ușor de detectat. Această lucrare analizează sistemul protein fosfatazelor induse în timpul lipsei de fosfat la diferite organisme.

1. Introducere

Reglarea proceselor celulare, cum ar fi diferențierea celulară, proliferarea, moartea celulară, mobilitatea, metabolismul, supraviețuirea și organizarea citoscheletului, ca răspuns la anumiți stimuli, este fundamentală pentru toate aspectele vieții celulare . Fosforilarea proteinelor este unul dintre cele mai frecvente mecanisme utilizate pentru a regla aceste procese. Procesele care sunt controlate în mod reversibil prin fosforilarea proteinelor necesită atât o proteinkinază, cât și o fosfatază proteică .

În mod tradițional, proteinele kinaze au fost studiate mai intens decât proteinele fosfataze datorită viziunii anterioare conform căreia proteinele kinaze conferă o reglare fină a fosforilării proteinelor, în timp ce proteinele fosfataze acționează doar pentru a elimina grupările fosfat. Abia în ultimul deceniu s-a realizat că proteinele fosfataze sunt, de asemenea, reglementate printr-o varietate de mecanisme și nu sunt mai puțin importante pentru fiziologia celulară decât proteinele kinaze . Proteinele fosfataze sunt capabile să hidrolizeze metaboliți fosfomonoesterici, eliberând fosfat anorganic (Pi) din aceste substraturi .

Fosforul, sub formă de fosfat anorganic (Pi), este unul dintre cei mai importanți macronutrienți pentru toate organismele . Nu numai că este utilizat în biosinteza componentelor celulare, cum ar fi ATP, acizii nucleici, fosfolipidele și proteinele, dar este, de asemenea, implicat în multe căi metabolice, inclusiv transferul de energie, activarea proteinelor și procesele metabolice ale carbonului și aminoacizilor . Cantități mari de fosfat sunt necesare pentru supraviețuirea celulelor. La plante, Pi este esențial pentru creștere și dezvoltare . La ciuperci, calea de transducție a semnalului Pi reglează expresia multor gene care răspund la fosfat și care sunt implicate în captarea și absorbția Pi din surse extracelulare . La paraziții tripanosomatidelor, Pi influențează capacitatea lor de a se dezvolta corect și de a coloniza în gazda nevertebrată .

În rezumat, proteinele fosfataze și kinaze sunt necesare pentru homeostazia Pi în timpul achiziției, stocării, eliberării și integrării metabolice a Pi . Scopul acestei lucrări este de a rezuma reglarea fosfatazelor de către fosfatul anorganic, cu accent pe rolul acestor enzime în biologia celulară.

2. Controlul retroactiv al fosfatazelor de către fosfatul anorganic: Calea PHO

Saccharomyces cerevisiae are mai multe fosfataze cu specificități diferite, localizare celulară și permeaze utilizate în captarea Pi. Setul de gene responsabile pentru aceste activități este reprimat în mod coordonat de concentrația de Pi din mediul de creștere . Achiziționarea, stocarea, eliberarea și integrarea metabolică a Pi de către celule necesită participarea mai multor enzime esențiale, cum ar fi fosfatazele acide extracelulare (APases), fosfodiesterazele, transportatorii de Pi, polifosfatul kinazele, fosfatazele alcaline (ALPases) și endopolifosfatazele . Activitățile acestor enzime sunt legate în mod intrinsec de homeostazia Pi și sunt supuse reglării prin intermediul căii de transducție a semnalului Pi (PHO) ca răspuns la niveluri variate de Pi .

Într-un model actual de reglare PHO, regulatorul pozitiv (sau factorul pozitiv) Pho4p, codificat de gena PH04, este indispensabil pentru activarea transcripțională a genelor PHO prin activitatea și localizarea sa. În mediu cu conținut ridicat de Pi, un complex de kinază dependentă de ciclină (CDK) format din Pho80p și Pho85p inhibă funcția Pho4p prin hiperfosforilare. Pho4p hiperfosforilat rămâne în citoplasmă și nu poate activa transcrierea genelor PHO . Atunci când concentrația de Pi din mediu este suficient de scăzută, Pho81p inhibă funcția complexului Pho80p-Pho85p , permițându-i lui Pho4p să se deplaseze în nucleu și să activeze transcrierea genelor PHO . Aceste gene codifică pentru transportatorii de înaltă afinitate Pho84p și Pho89p; fosfatazele acide secretate Pho5p, Pho11p și Pho12p; alte proteine înrudite care măresc recuperarea Pi din surse extracelulare .

Această cale PHO a fost descrisă în diferite organisme, cum ar fi plantele, bacteriile și ciupercile .

3. Sistemul fosfatazelor în drojdie

Ințial, s-a observat că mai multe gene de fosfatază sunt modulate de concentrația de Pi din mediul de cultură; astfel, calea PHO a fost inițial caracterizată de fosfatazele exprimate diferențiat .

În S. cerevisiae, transcrierea genelor care codifică fosfatazele acide și alcaline și transportatorul de Pi este reprimată și dereprimată în mod coordonat în funcție de concentrația de Pi din mediul de cultură . Majoritatea fosfatazelor sintetizate în condiții de limitare a Pi sunt localizate extracelular sau sunt asociate cu membrana plasmatică sau cu peretele celular.

Genele fosfatazelor reglate de Pi includ PHO5 , care codifică pentru fracțiunea majoră a fosfatazelor acide reprimabile (rAPase; pH optim 3-4; EC 3.1.3.2), și izozimele sale PHO10 și PHO11 . Aceste trei rAPaze sunt glicoproteine care se găsesc în peretele celular sau în spațiul periplasmatic. Ele sunt responsabile de captarea fosfaților și lucrează împreună cu transportatori de înaltă afinitate pentru a achiziționa fosfat atunci când concentrația de Pi din mediu este scăzută . RAPaza codificată de gena PHO5 este glicozilată în timpul secreției prin membrană și este localizată în spațiul periplasmic. Pho5p este responsabilă pentru >90% din activitatea APazei .

Pentru că produsul genei PHO5 constituie cea mai mare parte a fosfatazelor acide, reglarea PHO5 este esențială pentru homeostazia celulară a fosfaților. Activatorii transcripționali, Pho4p și Pho2p, sunt necesari pentru a genera structura activă a cromatinei în promotorul PHO5 și pentru a stimula transcripția. Pho80p-Pho85p este un complex de kinază dependentă de cicline/cicline care fosforilează Pho4p în mai multe locuri pentru a regla negativ funcția Pho4p. Huang și O’Shea au efectuat un screening enzimatic cantitativ și de mare randament al unei colecții de deleții de drojdie, căutând noi mutanți cu defecte în exprimarea PHO5. Dintre mutanții constitutivi, tulpinile pho80 și pho85 au prezentat cele mai ridicate niveluri ale activității fosfatazei Pho5 și ale ARNm PHO5 în condiții de conținut ridicat de fosfați, în concordanță cu rolul lor central în calea PHO. Pierderea completă a activității kinazei înalte (Pho80p-Pho85) are ca rezultat activarea completă a factorului de transcripție Pho4, ceea ce duce la exprimarea completă a PHO5.

O altă clasă importantă de fosfataze în S. cerevisiae este reprezentată de fosfatazele alcaline (ALPase; pH optim 8; EC 3.1.3.1). PHO8 codifică pentru o fosfatază alcalină reprimabilă nespecifică (rALPază). Este o glicoproteină localizată în vacuolă care scindează diverse substraturi pentru a prelua fosfatul din produsele intracelulare. Pho8p este o proteină dimerică dependentă de Mg2+/Zn2+, similară ALPazei din Escherichia coli și din celulele mamiferelor . Produsul enzimatic al PHO13 este o proteină monomerică și este specifică pentru p-nitrofenil fosfat (pNPP) și histidinil fosfat. Această enzimă a fost puternic activată de ionii Mg2+, cu un pH optim de 8,2 și o activitate specifică ridicată pentru pNPP, cu o valoare medie de 3,6 × 10-5 M .

4. Phosphorus Stress Modulates Acid Phosphatases in Plants

Fosfatazele acide (APases) pot fi active împotriva unei game largi de fosfați organici prezenți în sol. Aceste enzime sunt fosfohidrolaze nespecifice de monoester ortofosforic (EC 3.1.3.2) care scindă Pi din locurile de legătură esterică. Fosfatazele vegetale secretate mențin o activitate de 50% într-o gamă largă de pH-uri (4,0-7,6), o activitate de 80% într-o gamă largă de temperaturi (22°C-48°C) și sunt stabile la temperaturi de până la 60°C, ceea ce le face candidații ideali pentru enzimele active din sol.

Apazele sunt abundente în Arabidopsis și sunt reprezentate de cel puțin patru familii de gene. Un studiu recent al genomului adnotat al Arabidopsis a identificat secvențe pentru 1 His APază, 4 APaze fosfatice, 10 APaze ale proteinei de stocare vegetativă și 29 de APaze purpurii .

În ultimii ani, a existat un interes considerabil pentru APazele purpurii (PAPs). Analiza comparativă a structurii PAP-urilor de la plantele superioare și mamifere a permis identificarea secvenței conservate și a motivelor structurale în acest tip de enzime din multe specii eucariote .

Biochimic, PAPs din plante funcționează ca proteine homodimerice cu o masă moleculară de ~55 kDa per monomer, în timp ce PAPs de mamifere sunt de obicei proteine monomerice cu o masă moleculară de ~35 kDa . Multe PAP-uri sunt glicoproteine care sunt direcționate către calea secretorie . S-a constatat că o PAP de la Spirodela oligorrhiza este glicozilfosfatidilinositol ancorată în celulă . Din punct de vedere structural, PAP-urile vegetale au două domenii. Domeniul NH2 nu are funcție catalitică. Domeniul COOH are centrul metalic și este domeniul catalitic al enzimei. Un alt PAP de la Lupinus albus poate conține un al treilea domeniu, cu o structură asemănătoare cu cea a desaturaselor de steroli, la extremitatea carboxilică . Nu se știe cât de frecvente sunt ultimele două forme de modificare posttranslațională în PAP-urile din alte specii. PAP-urile sunt metaloenzime care au un complex binuclear de ioni metalici în situsul său activ. Culoarea lor caracteristică, de la roz la purpuriu, se datorează unei tranziții de transfer de sarcină de către un reziduu de tirozină care coordonează un ion feric . Această enzimă poate hidroliza esterii și anhidridele acidului fosforic .

PAPs au fost izolate din Phaseolus vulgaris (fasole comună) , Glycine max (soia) , Lupinus albus (lupin alb) , Lycopersicon esculentum (tomate) , Triticum aestivum (grâu) , Hordeum vulgare (orz) , Zea maize (porumb) și Oryza sativa (orez) .

Răspunsul plantelor la înfometarea cu Pi poate fi împărțit în două categorii: răspunsul specific și răspunsul general. Răspunsurile specifice promovează mobilizarea și achiziția eficientă a Pi din mediul de creștere și din depozitele intracelulare. Răspunsurile generale permit supraviețuirea pe termen lung prin coordonarea metabolismului celular cu disponibilitatea nutrienților și potențialul de creștere . Punerea în aplicare a acestor strategii necesită modificări ale profilurilor de expresie a sute de gene, după cum demonstrează analizele transcriptomului de la Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) .

În timpul foametei de Pi, plantele sporesc expresia fosfatazelor ca răspuns general . Producția de fosfatază este legată de deficiența de Pi și a fost propusă o corelație pozitivă între producția de fosfatază acidă și nutriția cu Pi . De exemplu, plante cum ar fi lupinul, care sunt mai eficiente în achiziționarea de Pi din sol, produc semnificativ mai multă fosfatază în comparație cu cerealele .

Wu et al. au analizat reglarea fosfatazelor proteice în Arabidopsis și au descoperit că trei gene pentru PAP au fost induse de foametea de Pi. În plus, gena At1g25230 a fost indusă de peste 2 ori, ceea ce arată că această genă este sensibilă la înfometarea cu Pi.

În genomul orezului, au fost identificate un total de 26 de gene PAP putative, iar înfometarea cu Pi a indus expresia a 10 gene PAP ale orezului, sugerând că acestea joacă roluri importante în aclimatizarea orezului la condiții de nivel scăzut de Pi .

În Lycopersicon esculentum (tomate), LePS2, este indusă de înfometarea cu Pi . Se remarcă faptul că fosfatazele LePS2 reprezintă primele fosfataze citoplasmatice care sunt componente ale răspunsului la inaniția de Pi . Suspendarea celulelor de tomate în mediu lipsit de Pi a dus la o creștere de aproximativ 4 ori a activității specifice PAP, dar activitatea specifică PAP a rămas scăzută și constantă în cazul celulelor menținute în mediu cu conținut ridicat de Pi. Creșterea activității PAP în cazul creșterii celulelor în mediu lipsit de Pi demonstrează că PAP ar putea avea un rol în creșterea disponibilității și utilizării Pi și poate fi esențial pentru mobilizarea Pi intracelulară prin detectarea lipsei de Pi în tomate .

5. Ectofosfatazele ca senzori de Pi

Membrana plasmatică a celulelor poate conține enzime ale căror situsuri active sunt orientate mai degrabă spre mediul extern decât spre citoplasmă. Activitățile acestor enzime, denumite ectoenzime, pot fi măsurate folosind celule intacte . Ectofosfatazele și ectokinazele au fost detectate în mai multe microorganisme, inclusiv protozoare , bacterii și ciuperci .

Multe studii au demonstrat un rol al ectofosfatazelor în dobândirea Pi pentru a fi utilizat în creșterea diferitelor tipuri de celule . În celulele ciupercilor (Fonsecae pedrosoi), epuizarea Pi din mediul de cultură induce, aparent, exprimarea diferitelor activități ectofosfataze . Cultivarea acestor ciuperci în absența Pi exogen s-a dovedit a avea ca rezultat generarea de celule fungice care exprimă o activitate ectofosfatază de 130 de ori mai mare decât cea exprimată de ciupercile cultivate în prezența Pi . Celulele de tripanosomatide au ectofosfataze care furnizează Pi prin hidroliza metaboliților fosfomonoesterici. De exemplu, la T. rangeli, o concentrație scăzută de Pi în mediul de creștere induce exprimarea unei activități diferite de ectofosfatază , sugerând că această enzimă conduce la hidroliza compușilor fosforilați prezenți în mediul extracelular. Această hidroliză ar putea contribui la achiziția de Pi în timpul dezvoltării epimastigotului T. rangeli.

În condiții de limitare a Pi, bacteriile fluorescente Pseudomona exprimă un set de gene de înfometare a fosfaților . De exemplu, cel puțin 56 de proteine de înfometare a Pi sunt induse în tulpina P. putida KT2442 , iar, în tulpina P. fluorescens DF57, a fost raportată inducerea mai multor gene de înfometare a fosfaților .

La multe eucariote, familia de proteine nucleotide pirofosfatază/fosfodiesterază (E-NPP) este direct responsabilă de hidroliza fosfaților din nucleotidele extracelulare. NPP1 până la -3 se găsesc în aproape toate tipurile de țesuturi umane, iar aceste enzime conțin un domeniu alcalin de ectonucleotidă pirofosfatază/fosfodiesterază de tip 1. În S. cerevisiae, NPP1 și NPP2 sunt upregulate prin transcripția reglată de Pi .

6. Observații finale

Pi este un compus care limitează creșterea în diverse organisme atunci când disponibilitatea sa este scăzută în multe ecosisteme . Inducerea activității fosfatazei ca răspuns la înfometarea cu Pi este un fenomen comun în rândul organismelor care achiziționează Pi din mediu. Aceste enzime sunt capabile să hidrolizeze substraturile fosforilate pentru a furniza o sursă de Pi în timpul lipsei de nutrienți. La Saccharomyces cerevisiae, semnalul de foamete de Pi declanșează o producție crescută a cel puțin patru tipuri de fosfataze: (1) fosfatazele acide Pho5, Pho11 și Pho12, care sunt localizate în spațiul periplasmatic; (2) fosfataza alcalină Pho8, care este localizată în vacuolă; (3) fosfataza glicerolică Hor2; (4) polifosfataza putativă Phm5, care este localizată în vacuolă. Toate aceste enzime pot contribui la creșterea nivelului de Pi liber . Cu toate acestea, alte funcții ar putea fi atribuite acestor enzime.

Del Pozo et al. au purificat o fosfatază acidă, AtACP5, care este indusă de inaniția de Pi în Arabidopsis thaliana. Această enzimă prezintă două activități, hidroliza substraturilor fosforilate și formarea de peroxid. Activitatea de fosfatază reflectă, probabil, un rol în mobilizarea Pi; activitatea de peroxidare sugerează că AtACP5 ar putea juca, de asemenea, un rol în metabolismul speciilor reactive de oxigen.

După toate acestea, fosfatazele induse de foamea de Pi joacă un rol în adaptarea organismului la stres, deși pot fi găsite și alte roluri.

Recunoștințe

Autorii mulțumesc pentru sprijinul financiar acordat de Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) și Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). C. F. Dick și A. L. A. Dos-Santos au contribuit în mod egal la această lucrare.

.