Sușe bacteriene și condiții de creștere

Sușe bacteriene sunt enumerate în tabelul suplimentar 2. Escherichia coli a fost cultivată pe plăci Luria Broth (LB) sau în mediu LB lichid, suplimentat cu 200 µg ml-1 de eritromicină la 37 °C. Transformarea E. coli cu ADN plasmidic a fost efectuată folosind celule competente din punct de vedere chimic. S. pneumoniae serotipul 2 D39 și serotipul 4 TIGR4 și mutanții izogeni ai acestora au fost crescuți pe plăci de geloză Columbia blood agar (Oxoid) care conțineau eritromicină (5 µg ml-1) și/sau cloramfenicol (5 µg ml-1), sau au fost cultivați în bulion Todd-Hewitt suplimentat cu 0,5 % extract de drojdie (THY; Roth) sau, respectiv, în mediu chimic definit (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences). Cultivarea pneumococilor pe agar sânge sau în culturi lichide a fost realizată la 37 °C și 5% CO2, fără agitare.

Construcția mutanților

Pentru construcția mutanților pneumococici tacL în D39 și TIGR4, s-a folosit un fragment de ADN format din S. pneumoniae D39 spd_1672 gena D39 și regiunile flancate în sus și în jos ale acesteia au fost amplificate prin PCR din ADN genomic utilizând primerul SPD1672_OLup_for și SPD1672_OLdwn_rev (primerii sunt enumerați în tabelul suplimentar 2). Produsele PCR purificate au fost clonate în pUC18 și celulele E. coli DH5α chimic competente au fost transformate cu plasmidul rezultat. Plasmidul recombinant pNH1 care adăpostește inserția de ADN dorită a fost purificat și utilizat ca șablon pentru o reacție PCR inversă cu primerul InvrevKpnISPD1672 și InvforPstISPD1672. Secvența genei ș terse a fost înlocuită cu o genă ermB, amplificată prin PCR din vectorul pTP1 cu ajutorul primerilor InvrevKpnIErm ș i InforPstIErm. Plasmidul recombinant final a fost utilizat pentru a transforma ș i mutageniza pneumococii. Eficiența transformării a fost evaluată folosind plasmidul recombinant final față de un alt plasmid de deleție a genei (pentru deleția genei cbpL) în S. pneumoniae D39Δcps 44. În mod remarcabil, eficiența transformării a fost astfel semnificativ crescută pentru deleția tacL (2,8 colonii per ng de plasmidă pentru cbpL față de 29,8 colonii per ng de plasmidă pentru tacL).

Mutanții izogenici au fost completați cu un sistem in trans bazat pe pBAV1CpE; pBAV1CpE a fost modificat din pBAV1K-T5-gfp45, prin înlocuirea genei de rezistență la kanamicină cu o genă de rezistență la cloramfenicol și a promotorului T5 cu o regiune promotoare de eritromicină (pE), care include situsul de legare a ribozomului și codonul de start. Gena spd_1672 completă a fost amplificată prin PCR folosind primerul 1672_com_for și Spd1672_com_rev, iar fragmentul purificat a fost clonat în pBAV1CpE. Plasmidul rezultat, pBAV-tacL, a fost utilizat pentru a transforma mutanți tacL izogeni. Deleția de tacL, precum și complementarea in trans au fost verificate cu ajutorul qRT-PCR (figura suplimentară 3).

PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR)

Steaua D39 de tip sălbatic încapsulată și neîncapsulată, mutantul cu deficit de tacL și mutantul completat au fost cultivate în THY până la jumătatea fazei log (A 600 = 0,35-0,45) și recoltate pentru izolarea ARN cu ajutorul kitului de purificare universală a ARN-ului EURx GeneMatrix (roboklon). Calitatea ARN-ului a fost verificată prin electroforeză pe gel de agaroză și PCR standard utilizând primerul EnoRT_F și EnoRT_R (a se vedea tabelul suplimentar 2). Sinteza ADNc a fost realizată cu ajutorul SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher) și a primerilor hexameric_random (GE Healthcare) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Calitatea ADNc a fost controlată prin PCR utilizând primerul EnoRT_F și EnoRT_R, iar concentrația a fost măsurată prin nanodrop. ADNc a fost depozitat la -20 °C până la testele ulterioare. Pentru experimentele de qRT-PCR, s-au utilizat StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) și SYBR® Green Master Mix (Biorad) în combinație cu amorse specifice tacL, precum și amorse de enolază ca martor (a se vedea tabelul suplimentar 2). Pentru analiza datelor s-a utilizat software-ul StepOne (v. 2.3, Life Technologies). Rezultatele finale sunt prezentate ca magnitudine a fluorescenței (ΔRn) reprezentată grafic în funcție de numărul de cicluri PCR.

Secvențiere și analiză bioinformatică

Secvențiere: 1 ng de ADN cromozomal purificat din S. pneumoniae tulpinile D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), și TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) a fost utilizat pentru a pregăti biblioteci individuale utilizând și urmând kitul Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kit. Un bioanalizator Agilent Technology 2100 a servit la verificarea marcării și a distribuției finale a dimensiunii fragmentelor de bibliotecă pe un cip ADN de înaltă sensibilitate. Pentru purificarea bibliotecilor de ADN au fost utilizate margele AMPure XP. Biblioteca finală grupată a fost aplicată pe un kit MiSeq Reagent v3 600cycle și secvențiată pe un sistem MiSeq ca o serie de 300 de cicluri împerecheate. Grupul final de biblioteci a fost îmbogățit cu 5% din biblioteca de control PhiX. S-a obținut o densitate a clusterelor de 847 ± 25 (K mm-2), 96,46 ± 1,48% dintre clustere trecând de specificațiile filtrului. 20,3 milioane de citiri (94,7 %) din totalul de 21,1 milioane de citiri au trecut specificațiile de filtrare, ceea ce a dus la 12,52 Gbp de date de secvență. Lecturile indexate au fost distribuite în mod egal între cele șase probe individuale. Fișierele FASTQ generate au fost supuse unor analize bioinformatice suplimentare, după cum se arată mai jos.

Detectarea și adnotarea SNP: Detectarea SNP a fost efectuată pentru S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL în mod individual folosind „snippy” (https://github.com/tseemann/snippy; parametru: porțiunea minimă pentru dovada variantei: 60%; acoperirea minimă a locului variantei: ≥5 secvențe citite). Ca genom de referință s-a folosit Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) sau Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3).

SNPS-urile rezultate pentru fiecare grup de mutanți (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) și (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) au fost îmbinate și comparate. Acoperirea genomului a fost estimată cu qualimap46 folosind aceleași genomuri de referință ca pentru detectarea SNP.

Isolarea acizilor teicoici pneumococici

Extracția și izolarea LTA: Purificarea LTA a fost realizată în principiu așa cum a fost descrisă în altă parte7 , dar pentru a optimiza randamentul pnLTA, a fost modificat un detaliu specific. Celulele pneumococice au fost resuspendate în tampon de citrat (50 mM, pH 4,7) și au fost dislocate de trei ori prin presă franceză (Constant Cell Disruption System, nr. de serie 1020) la 10 °C la o presiune de 20 kPSI. S-a adăugat SDS la o concentrație finală de 4 % în supernatantele combinate. Soluția a fost incubată timp de 30 de minute la 100 °C și a fost agitată ulterior peste noapte la temperatura camerei. Soluția a fost centrifugată la 30.000×g timp de 15 minute la 4 °C. Peletul a fost spălat de patru ori cu tampon citrat, folosind condițiile de centrifugare de mai sus. Supernatantele combinate care conțin LTA și sedimentul rezultat, care conține complexul brut PGN-WTA, au fost liofilizate separat. Solidele rezultate au fost ambele spălate de cinci ori cu etanol (centrifugare: 20 min, 20 °C, 10 650 × g) pentru a elimina SDS și au fost liofilizate (rezultând un sediment A care conține LTA și un sediment B care conține complexul PGN-WTA). Pentru izolarea LTA, peleta A a fost resuspendată în tampon citrat și extrasă cu un volum egal de butan-1-ol (Merck) la temperatura camerei, sub agitare energică. Fazele au fost separate prin centrifugare la 2 100 × g timp de 15 minute la 4 °C. Faza apoasă (care conține LTA) a fost colectată, iar procedura de extracție a fost repetată de două ori cu faza organică plus faza intermediară. Fazele apoase combinate au fost liofilizate și, ulterior, dializate timp de 5 zile la 4 °C în soluție tampon de acetat de amoniu 50 mM (pH 4,7; membrană de 3,5 kDa); tamponul a fost schimbat la fiecare 24 de ore. LTA brută rezultată a fost purificată în continuare prin cromatografie de interacțiune hidrofobă (HIC) realizată pe o coloană HiPrep Octyl-Sepharose (GE Healthcare; 16 × 100 mm, volum al patului 20 ml). Materialul LTA brut a fost dizolvat în cât mai puțin tampon de pornire [15 % propan-1-ol (Roth) în acetat de amoniu 0,1 M (pH 4,7)] și centrifugat la 13 000 × g timp de 5 minute la temperatura camerei, iar supernatantul rezultat a fost liofilizat. Peletul care conține LTA a fost dizolvat în tamponul de pornire HIC la o concentrație de 30 mg ml-1 și purificat prin HIC utilizând un gradient liniar de la 15 până la 60 % propan-1-ol (Roth) în acetat de amoniu 0,1 M (pH 4,7). Fracțiunile care conțin LTA au fost identificate cu ajutorul unui test fotometric de fosfat47. Fracțiunile care conțin fosfați au fost combinate, liofilizate și spălate cu apă la liofilizare pentru a elimina tamponul rezidual.

Extracția și izolarea WTA: Izolarea și extracția WTA a fost efectuată așa cum este descrisă în altă parte11 , dar cu modificări minore. Pelletul B (care conține complexul brut PGN-WTA), care a apărut în timpul izolării LTA, a fost resuspendat la o concentrație de 10 mg ml-1 în 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) care conține 20 mM MgSO4. DNază A și RNază I au fost adăugate la concentrații finale de 10 și, respectiv, 50 µg ml-1 . Suspensia a fost agitată timp de 2 ore la 37 °C. Ulterior, s-au adăugat 10 mM CaCl2 ș i tripsină (100 µg ml-1) ș i s-a continuat agitarea peste noapte la 37 °C. S-a adăugat SDS la o concentrație finală de 1%, iar amestecul a fost incubat timp de 15 minute la 80 °C pentru a inactiva enzimele. Peretele celular a fost recuperat prin centrifugare timp de 45 de minute la 130.000×g la 25 °C. Peletul rezultat a fost resuspendat în 0,8 ml de LiCl 8 M la 1 ml de soluție Tris-HCl utilizată inițial și incubat timp de 15 minute la 37 °C. După o nouă centrifugare în aceleași condiții ca cele de mai sus, peticul a fost resuspendat în 1 ml de acid etilendiaminotetraacetic (EDTA, pH 7,0) 10 mM pentru fiecare ml de soluție Tris-HCl utilizată inițial, iar acest eșantion a fost incubat la 37 °C timp de 15 minute. Pastilul a fost spălat de două ori cu apă. În cele din urmă, peletul a fost resuspendat în 2-4 ml de apă și liofilizat, obținându-se complexul PGN-WTA purificat. În funcție de întrebarea specifică de cercetare, s-au efectuat ulterior alte tratamente chimice sau enzimatice.

Tratamente chimice și enzimatice

Tratament cu hidrazină al LTA: LTA purificat a fost dizolvat la o concentrație de 5 µg µl-1 în hidrazină anhidră (N2H4; ICN Biomedicals) înainte de a fi incubat timp de 1 h la 37 °C sub agitare. Reacția a fost stinsă prin adăugarea aceluiași volum de acetonă și uscată sub un curent de azot; etapa de uscare a fost repetată de două ori. Ulterior, LTA brut de-O-acilatat a fost purificat prin cromatografie cu permeabilitate în gel (GPC) pe o coloană Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; dimensiunea coloanei: 1,5 × 120 cm; tampon: 150 mM acetat de amoniu (pH 4,7)).

Digestia enzimatică a complexului PGN-WTA: Pentru a elimina toți aminoacizii din PGN, complexul PGN-WTA a fost dizolvat în 50 mM Tris-HCl (pH 7,0; 10 mg ml-1) și tratat cu amidaza pneumococică LytA, așa cum este descris în altă parte11. Amidaza LytA recombinantă marcată His (10 µg LytA per mg) a fost adăugată în trei alicote după 0, 24 și 48 de ore, pentru o perioadă totală de incubare de 72 de ore la 37 °C. Ulterior, enzima a fost inactivată prin fierbere timp de 5 minute la 100 °C. După centrifugare (25 000 × g, 15 minute, 20 °C), supernatantul a fost colectat și liofilizat. Complexul brut PGN-WTA tratat cu LytA a fost purificat în continuare prin GPC pe o coloană Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; dimensiunea coloanei: 1,5 × 120 cm; tampon: 150 mM acetat de amoniu (pH 4,7)). Materialul cu greutate moleculară ridicată obținut (~12 mg) a fost în continuare digerat cu lizozimă (200 µg; Sigma) și mutanolizină (200 µg; Sigma) într-un amestec de reacție de 800 µl care conține fosfat de sodiu (20 mM; pH 4,8) și azidă de sodiu (0,02%) la 37 °C peste noapte. Enzimele au fost inactivate prin încălzire la 100 °C timp de 5 minute. Materialul solubil a fost recuperat prin centrifugare (18 000 × g, 10 minute, 20 °C) și liofilizat. Izolarea pnWTA legată de fragmente mici de PGN a fost realizată printr-o GPC finală folosind condițiile menționate mai sus.

Spectroscopie RMN

Măsurătorile spectroscopice RMN au fost efectuate în D2O la 300 K pe un Bruker AvanceIII 700 MHz (echipat cu o criosonda cu patru rezonanțe cvadruple de 5 mm cu grad Z inversat). Solvenții deuterați au fost achiziționați de la Deutero GmbH (Kastellaun, Germania). Acetona a fost utilizată ca standard extern pentru calibrarea spectrelor RMN 1H (δH 2,225) și 13C (δC 30,89). Spectrele RMN 31P (δP 0,0) au fost calibrate cu acid fosforic 85% în D2O ca standard extern. Atribuțiile RMN 1H au fost confirmate prin experimente bidimensionale 1H, 1H COSY și TOCSY, iar atribuțiile RMN 13C au fost indicate prin HSQC bidimensional 1H, 13C HSQC, pe baza atribuțiilor RMN 1H. Conectivitatea interreziduală și dovezi suplimentare pentru atribuirea 13C au fost obținute prin experimente bidimensionale 1H, 13C HMBC și 1H, 13C HSQC-TOCSY. Conectivitatea grupului fosfat a fost atribuită prin 1H, 31P HMQC bidimensional și 1H, 31P HMQC-TOCSY. Toate datele au fost achiziționate și prelucrate utilizând Bruker TOPSIN V 3.0 sau o versiune superioară.

Spectrometrie de masă

Pentru a analiza pnWTA legată de fragmente mici de PGN, s-a efectuat spectrometrie de masă cu rezonanță de rezonanță de ciclotron cu ionizare prin electrospray cu transformare Fourier (ESI-FT-ICR-MS) pe un instrument APEX Qe de 7 Tesla (Bruker Daltonics, Bremen, Germania) folosind modul de ioni negativi și un amestec de apă/propan-2-ol/7 M de trietilamină/acid acetic (50:50:0.06:0,02 v/v/v/v/v) ca solvent, așa cum a fost descris anterior6. Analiza MS a LTA tratată cu hidrazină a fost efectuată pe un Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bremen, Germania) în modul cu ioni negativi, utilizând același solvent. S-a utilizat o sursă de ioni Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, SUA) cu o tensiune de pulverizare setată la -1,1 kV. Scara de masă a fost calibrată din exterior cu glicolipide cu structură cunoscută, iar toate spectrele au fost deconvoluționate în funcție de sarcină. Numerele de masă date se referă la masa monoizotopică a moleculelor neutre.

Microscopie electronică

Microscopie electronică de baleiaj cu emisie de câmp: bacteriile au fost fixate în mediul de creștere cu 5% formaldehidă și 2,5% glutaraldehidă timp de 1 h la gheață și spălate cu tampon HEPES (HEPES 0,1 M, 0,09 M zaharoză, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9). O parte alicotă de 50 µl din soluția bacteriană fixată a fost așezată pe lamele acoperite cu polilizină și s-a lăsat să se așeze timp de 10 minute. După fixarea cu glutaraldehidă 2% în PBS timp de 5 minute la temperatura camerei, lamela de acoperire a fost spălată cu tampon TE (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9) înainte de a fi deshidratată într-o serie graduală de acetonă (10, 30, 50, 70, 90 și 100%) la gheață timp de 10 minute pentru fiecare etapă. Probele din etapa cu acetonă 100% au fost lăsate să ajungă la temperatura camerei înainte de o nouă schimbare în acetonă 100% înainte de uscarea în punct critic cu CO2 lichid (CPD 30, Balzers, Liechtenstein). Eșantioanele uscate au fost acoperite cu o peliculă de paladiu-aur prin acoperire cu pulverizare (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) înainte de a fi examinate într-un microscop electronic de scanare cu emisie de câmp Zeiss Merlin (Oberkochen, Germania), utilizând detectorul HESE2 Everhart Thornley SE și detectorul SE în lentilă într-un raport de 25:75 la o tensiune de accelerare de 5 kV.

Microscopie electronică de transmisie: bacteriile au fost fixate ca mai sus și fixate suplimentar cu tetroxid de osmiu (1% în tampon HEPES) timp de 1 h la temperatura camerei. După spălarea cu tampon HEPES, probele au fost deshidratate cu 10, 30 și 50% acetonă pe gheață înainte de incubarea în 70% acetonă cu 2% acetat de uranil peste noapte la 7 °C. Probele au fost în continuare deshidratate cu 90 și 100% acetonă pe gheață, lăsate să ajungă la temperatura camerei și în continuare deshidratate cu 100% acetonă, apoi schimbate în 100% etanol. Ulterior, probele au fost infiltrate cu rășina acrilică aromatică LRWhite. După polimerizare timp de 2 zile la 50 °C, secțiunile ultrasubțiri au fost tăiate cu un cuțit de diamant, colectate pe grile de 3000 de ochiuri de plasă acoperite cu butvar și contracolorate cu acetat de uranil apos de 4% timp de 3 minute. Probele au fost imaginate într-un Zeiss TEM 910 la o tensiune de accelerare de 80 kV și la magnificații calibrate.

Contrastul și luminozitatea au fost ajustate cu Adobe Photoshop CS3.

Generarea anticorpilor

Anticorpii policlonali împotriva CBP-urilor analizate au fost crescuți la șoareci folosind protocoale de imunizare de rutină. Pe scurt, șoarecii CD-1 au fost imunizați intraperitoneal cu 20 µg de proteină recombinantă și adjuvant incomplet Freund’s (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) (50:50 v/v). În zilele 14 și 28, șoarecii au fost injectați cu 20 µg de proteină și adjuvant incomplet Freund (50:50 v/v). Șoarecii au fost sângerate în ziua 42 și IgG policlonale au fost purificate din ser cu ajutorul proteinei A-Sepharose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania). Anticorpii sunt enumerați în tabelul suplimentar 2.

Citometrie în flux

S. pneumoniae D39 de tip sălbatic, mutantul său isogen tacL și mutantul completat au fost cultivate în mediu THY până la jumătatea fazei log, recoltate la 3 275 × g timp de 6 minute și spălate cu PBS (pH 7,4). Pentru cuantificarea conținutului de capsule, o suspensie de 100 µl conținând 4 × 108 bacterii a fost incubată cu antiseruri de polizaharide anticapsulare (ser de tip SSI 2, Statens Serum Institute) (1:500 în PBS) timp de 30-45 min la 37 °C și 5% CO2 în plăci de 96 de puțuri (cu fundul în U, Greiner Bio-One). După spălare, probele au fost incubate cu un anticorp secundar anti-rabbit IgG de capră cuplat cu Alexa488 (Invitrogen) (1:500 în PBS, 30-45 min, 37 °C). După spălarea cu PBS, bacteriile au fost fixate cu formaldehidă 1% peste noapte la 4 °C.

Abordanța CBP-urilor, precum și cantitatea de acizi teicoici în tulpinile D39 neincapsulate de tip sălbatic, mutant și completat au fost măsurate prin citometrie în flux după fixarea cu formaldehidă 1% timp de 1 h la 4 °C. Două sute de µl de suspensii conținând 8 × 108 bacterii au fost incubate cu anticorpi policlonali specifici împotriva diferitelor CBP (1:500 în PBS) sau, pentru cuantificarea TA, cu anticorpi împotriva P-Cho (TEPC-15) sau a antigenului Forssman (15 minute la 37 °C și 5% CO2) în plăci cu 96 de puțuri (cu fundul în U, Greiner Bio-One). După spălare, probele au fost incubate cu un anticorp secundar de capră anti-IgG cuplat cu Alexa488 marcat cu Alexa488 (Invitrogen) (15 min, 37 °C). Fluorescența a fost determinată cu ajutorul unui FACS Calibur™ (BD Biosciences).

Analiză imunoblot

S. pneumoniae D39, mutantul său isogen tacL și mutantul completat au fost crescute în mediu THY până când s-a atins un A 600 de 0,35-0,45, recoltate prin centrifugare la 3270×g la 4 °C timp de 6 minute și resuspendate în 1 ml de tampon PBS la pH 7,4. Un total de 2 × 108 celule pe puț a fost încărcat și analizat pe un SDS-PAGE de 12 % înainte de a fi transferat pe o membrană de nitroceluloză prin semi-stopare. Membranele au fost blocate timp de 2 ore la temperatura camerei cu lapte degresat 5% (Roth) și soluție salină tamponată cu Tris (TBS; pH 7,4) și au fost incubate peste noapte la 4 °C cu anticorpi policlonali de șoarece împotriva diferitelor CBP (1:500 în lapte degresat 5% + TBS 0,01% Tween (T-TBS)). Un anticorp policlonal de iepure împotriva enolazei (1:25.000 în lapte degresat 5% + T-TBS) a fost utilizat ca un control de încărcare. Membranele au fost spălate cu T-TBS, CBP-urile au fost detectate cu IRDye® 800CW secundar marcat cu fluorescență. IgG de capră α-șoarece și enolază au fost detectate cu IRDye® 680RD marcat prin fluorescență. Anticorpul de capră α-rabbit IgG a fost detectat prin incubarea cu anticorpul corespunzător (1:15.000 în lapte degresat 5% în T-TBS) timp de 45 de minute la întuneric, la temperatura camerei; membranele au fost spălate cu T-TBS și, în final, o dată cu TBS. Scanarea membranelor a fost efectuată cu ajutorul unui scaner Odyssey® CLx (LI-COR).

Sensul autolizei induse de Triton X-100

S. pneumoniae D39 de tip sălbatic, mutant și tulpina completată au fost cultivate în mediu THY până la mijlocul fazei log, recoltate la 3275×g timp de 6 min și spălate cu PBS (pH 7,4). O suspensie de 1 ml conținând 1 × 109 bacterii a fost incubată cu o concentrație finală de 0,01% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) și incubată la 37 °C. Liza celulelor bacteriene a fost monitorizată prin măsurarea absorbanței la 600 nm la intervale de timp prestabilite.

Dezvoltarea aderenței epiteliale

Aderința pneumococică la celulele epiteliale a fost analizată cu celule umane A549 (ATCC® CCl-185TM) așa cum a fost descrisă48. Pe scurt, celulele epiteliale confluente, crescute pe lamele de sticlă (Hartenstein; în plăci cu 24 de godeuri, ~1 × 105 celule pe gode) au fost inoculate cu 5 × 106 pneumococi crescuți la mijlocul perioadei de expansiune și incubate în mediu de infecție (DMEM (HyClone™) + 1% ser fetal bovin fetal inactivat termic (FBS)) la 37 °C și 5% CO2. Ulterior, celulele au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat conținând 1% FBS (Gibco) pentru a elimina bacteriile nelegate. Ulterior, bacteriile au fost fixate cu PBS conținând 1% para-formaldehidă (PFA, Roth).

Microscopie de imunofluorescență

Pneumococii fixați, legați de celulele A549 au fost spălați de trei ori cu PBS și blocați timp de 1 h la temperatura camerei folosind PBS + 10% FBS. După spălare, probele au fost incubate timp de 1 h la temperatura camerei cu un anticorp policlonal (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) împotriva pneumococilor (generat la iepure împotriva S. pneumoniae TIGR4 și D39 inactivat termic). Ca anticorp secundar, s-a utilizat un anticorp de capră anti-rabbit Alexa-Fluor488 marcat cu fluorescență (Abcam) (1:500, 1 h, la temperatura camerei). Aderența bacteriană a fost monitorizată pentru cel puțin 20 de celule per lamelă de acoperire de clasă, utilizând microscopia cu fluorescență. Fiecare experiment a fost repetat de trei ori în dublu exemplar. Toate datele sunt raportate ca medii ± s.d. Analiza statistică a fost efectuată cu ajutorul testului Student’s t cu două cozi nepereche. În toate analizele, o valoare p de <0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.

Experimente de fagocitoză

Test de protecție antibiotică: Un strat confluent de celule monocitice THP-1 (ATCC® TIB-202TM) cultivate în plăci cu 24 de puțuri [3 × 105 celule pe puț în RPMI-1640 (HyClone™) suplimentat cu 10% ser fetal bovin inactivat termic (FBS, Gibco)] a fost diferențiat în fagocite prin adăugarea a 200 nmol ml-1 de forbol 12-miristat 13-acetat (PMA, Sigma-Aldrich) și incubat timp de 48 h la 37 °C și 5% CO2. Ulterior, celulele THP-1 au fost spălate cu RPMI-1640 suplimentat cu 10% FBS inactivat termic și incubate timp de încă 24 h la 37 °C și 5% CO2. Înaintea infecției, pneumococii au fost cultivați în THY până la faza logaritmică medie (A 600 = 0,35-0,45), centrifugați și spălați cu mediu de infecție (RPMI-1640 suplimentat cu 1% FBS inactivat termic). Celulele THP-1 au fost spălate și infectate cu pneumococi în 500 µl de mediu de infecție. Infecția a fost sincronizată prin centrifugare (2 minute, 300×g) pentru a iniția un contact simultan între bacterii și fagocite. Ulterior, celulele au fost incubate la 37 °C și 5% CO2 pentru diferite perioade de timp. După infecție, celulele au fost spălate cu mediul de infecție și incubate cu Penicilină G (100 unități ml-1, Sigma-Aldrich) și Gentamicină (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) timp de 1 h la 37 °C și 5% CO2 pentru a distruge bacteriile extracelulare. Apoi, fagocitele au fost spălate și lizate cu 1% saponină (Sigma-Aldrich) pentru a elibera pneumococii intracelulari. Unitățile formatoare de colonii (ufc) de bacterii intracelulare au fost determinate prin însămânțarea bacteriilor în diluții corespunzătoare pe plăci de agar sânge (Oxoid)49. Uciderea în funcție de timp a pneumococilor intracelulari a fost evaluată prin uciderea pneumococilor extracelulari cu ajutorul antibioticelor descrise mai sus. După aceea, fagocitele au fost incubate în continuare în mediul de infecție pentru diferite perioade de timp (0-3 h). Cfu bacteriene intracelulare au fost monitorizate conform descrierii de mai sus. Toate experimentele au fost repetate de patru ori ca duplicate. Datele au fost normalizate în testele de protecție antibiotică la multiplicitatea de infecție (MOI) sau în uciderea dependentă de timp la bacteriile recuperate la punctul de timp 0 h. Toate testele au fost analizate utilizând ANOVA cu o singură cale cu corecția Bonferroni.

Dupla colorare prin imunofluorescență și microscopie

Celele THP-1 diferențiate cu PMA (3 × 105 celule pe puț) au fost cultivate pe suporturi de sticlă sterilă (12 mm, Hartenstein) și infectate cu pneumococi așa cum s-a descris mai sus. După infectare, celulele THP-1 au fost spălate cu mediul de infecție și fixate cu paraformaldehidă 4% (Roth) peste noapte la 4 °C. Plăcuțele de sticlă au fost spălate cu PBS și blocate cu PBS + 10% FBS inactivat termic timp de 1 h. După spălare, bacteriile extracelulare au fost colorate cu o IgG policlonală de α-pneumococi (1:500) și cu o IgG secundară de capră α-iepure marcată cu Alexa-Fluor488 (1:500, Abcam) timp de 30 min la temperatura camerei. Plitele de sticlă au fost spălate de trei ori cu PBS după permeabilizarea celulelor THP-1 cu 0,1% Triton X-100 în PBS (10 min, la temperatura camerei). După spălare, pneumococii intracelulari au fost colorați cu o IgG policlonală de α-pneumococi (1:500) și o IgG secundară de capră α-rabin marcată cu Alexa-Fluor568 (1:500, Abcam) timp de 30 min la temperatura camerei. Experimentele au fost repetate de trei ori ca duplicate. Pentru analiza statistică, 50 de celule per lamelă de sticlă au fost analizate pentru numărul de bacterii intracelulare. Datele au fost normalizate în funcție de MOI. Toate testele au fost analizate utilizând ANOVA cu o singură cale cu corecție Bonferroni. În toate analizele, o valoare p de <0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.

Liniile celulare

Toate liniile celulare utilizate în acest studiu au fost achiziționate de la ATCC (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202) și au fost testate pentru a fi micoplasma-negative prin PCR și microscopie electronică de scanare.

Model de pneumonie acută la șoareci și de infecție sistemică

Șoareci CD-1 de sex feminin în vârstă de 8 până la 10 săptămâni (outbred, Charles River, Sulzfeld, Germania) au fost infectați intranazal cu pneumococi bioluminescenți, așa cum a fost descris recent50. Pe scurt, pneumococii au fost cultivați până la faza exponențială medie (A 600 = 0,35) în mediu THY care conține 10% ser fetal bovin inactivat termic. După centrifugare, doza de infecție (20 µl) a fost ajustată la ~2,5 × 107 ufc în PBS (pH 7,4). Pentru infecția nazală, șoarecii au fost anesteziați prin injectare intraperitoneală de ketamină/xilazină (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Germania; Rompun, Provet AG, Lyssach, Germania), iar bacteriile au fost administrate picătură cu picătură în nări. Doza de ufc din doza de infecție a fost confirmată prin însămânțarea unor diluții în serie ale inoculului pe plăci de agar sânge. Șoarecii au fost monitorizați în ceea ce privește supraviețuirea și au fost supuși unui test de bioluminescență la intervale de timp prestabilite cu ajutorul sistemului IVIS® Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, SUA). Pentru modelul de infecție sistemică, o doză de infecție de 3 × 103 ufc a fost administrată intraperitoneal într-un volum de 200 µl PBS (pH 7,4). Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu reglementările germane ale Societății pentru Știința Animalelor de Laborator (GV-SOLAS) și cu Legea Europeană a Sănătății a Federației Asociațiilor pentru Știința Animalelor de Laborator (FELASA). Toate experimentele au fost aprobate de Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Germania, permisul nr. 7221.3-1-056/16-1).

Disponibilitatea datelor

Arhivele FASTQ brute care conțin datele de secvență genomică S. pneumoniae au fost transmise la EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) și stocate în Short Read Archive (SRA) sub numărul de acces la studiu RJEB18558. Toate celelalte date relevante care susțin constatările studiului sunt disponibile în acest articol și în fișierele de informații suplimentare ale acestuia sau de la autorii corespondenți, la cerere.

.